[发明专利]一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法

摘要

本发明公开了一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，包括在处理好的培养体系加入CD16单抗，ATG,IL‑2，37^oC培养箱中孵育，计数，换液，添加新鲜IL‑2；定期换培养液，继续培养适当时间得到人自然杀伤细胞。本发明的有益效果是：NK细胞在不进行磁珠分离,肿瘤修饰细胞刺激的情况下，应用ATG,CD16单抗短时间内得以高效扩增，极大程度上节约了生产成本且操作简便；NK细胞的扩增倍数达千倍以上，终比例达到80%‑93%；生产效率较高，完全可以应用于大规模临床研究等；NK细胞的生长过程均在GMP条件下完成，保证无菌操作，并且在生产最后阶段进行各种安全检测，可应用于临床研究。

主权项

1.一种人自然杀伤细胞体外高效扩增方法，其特征在于，包括以下步骤:a、配制细胞完全培养液，备用；所述完全培养液含有2mM Gluta‑MAX和100μg/ml青链霉素，其余为GMP CellGroR DC Serum‑free Medium与胎牛血清混合物或GMP CellGroR DC Serum‑free Medium与自体血清混合物；b、取室温淋巴细胞分离液，将备用的人外周血液倒入淋巴细胞分离液面上，第一次离心,形成细胞分层；c、吸取所述步骤b所得所述细胞分层中的白膜层细胞于一新离心管中，用磷酸盐缓冲液洗涤，第二次离心，得白膜层细胞团；d、将所述步骤c的白膜层细胞团用磷酸盐缓冲液洗涤，弃去上层清液，得到细胞；e、将所述步骤d所得的细胞用步骤a所配制的完全培养液重新悬浮，计数并调整活细胞浓度至0.5×106‑2×106 cells/ml；f、将e步骤所得细胞加入细胞培养板中，并于细胞培养板中加入CD16单抗，ATG, IL‑2记为第一天;将所述细胞培养板放入37℃ 培养箱中孵育适当时间后，更换所述完全培养液，第二次添加新鲜IL‑2；g、之后定期更换所述细胞完全培养液，培养适当时间，得到人自然杀伤细胞；其中，所述ATG 浓度为50 ng/ml ‑1000ng/ml, CD16 单抗浓度为 2μg/ ml‑100μg/ml；IL‑2浓度为200U/ml‑1000U/ml;所述第二次添加新鲜IL‑2，使IL‑2的浓度为200 U/ml‑1000U/ml。