[发明专利]基于飞行时间质谱法联合特异Tags序列进行SNP分型方法的建立(MS-SSTA)

摘要

本发明是基于飞行时间质谱法联合特异的Tags序列和寡核苷酸连接反应建立的SNP分型方法，主要是利用位点特异性的Tags序列和寡核苷酸连接反应，经过PCR、限制性内切酶酶切反应，通过MALDI–TOF质谱检测连接Tags一段序列的分子量大小，通过Tags序列所对应的碱基类型，实现对SNP位点的分型。与现有的方法相比，通过检测不同Tags的分子量差异实现SNP分型，提高了质谱检测的范围，同时提高了检测的灵敏度。另外，可同时对多个SNP位点进行检测，具有操作简单，成本低的特点。

主权项

基于飞行时间质谱法联合特异Tags序列进行SNP分型的方法包括以下几个步骤：（1）针对SNP位点，设计3条寡核苷酸探针，第一条和第二条探针的3^/ 端分别是预先选定SNP位点的两个等位基因型，即等位基因特异性寡核苷酸探针（allele‑specific oligos，ASO），第三条探针与所选定位点的靶序列下游互补，且位于选定SNP位点的下游，即位点特异性寡核苷酸探针（locus‑specific oligo，LSO）；（2）对三条寡核苷酸探针进行相应的修饰，然后将经过修饰的多个SNP位点的探针混合，形成探针池；（3）当与目标序列完全匹配时，在Taq DNA连接酶的作用下，经过修饰的等位基因特异性寡核苷酸片段和位点特异性寡核苷酸探针进行连接，得到连接产物；（5）采用通用PCR引物扩增连接产物，其中Tags序列5^/ 端需要进行生物素修饰，这样PCR产物中有一条链是生物素标记的，便于后续纯化；（6）使用限制性内切酶将PCR产物进行酶切，并使用链霉亲和素包被的beads进行纯化；（7）将纯化产物移至384孔芯片上，使用飞行时间质谱分析，检测携带特异Tags片段分子量的大小，并根据其分子量的差异来确定样品中该SNP位点的基因型。