[发明专利]一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法

摘要

本发明公开了一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，包括以下步骤：(1)合成3对NET-1siRNA序列，并使之生物素化；(2)制备生物素化纳米微泡；(3)合成生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸；(4)通过生物素-亲和素系统将上述步骤的生物素化NET-1siRNA、生物素化纳米微泡和生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸偶联，即得携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。本发明的肝癌靶向纳米微泡不仅可以作为靶向超声对比剂用于临床超声诊断，同时更重要的是由于其携带的NET-1siRNA具有抑制肿瘤生长作用而使得它还可以用于肝癌基因治疗。

主权项

一种携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成3对NET‑1 siRNA序列，并使之生物素化：3对NET‑1 siRNA序列分别为SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:6所示，且均经FAM荧光和生物素标记，得到生物素化NET‑1 siRNA，冻干分装，‑20℃保存；(2)制备生物素化纳米微泡：将DSPC、DSPE‑PEG2000和DSPE‑PEG2000‑biotin溶解于氯仿与甲醇混合溶液中，于旋转蒸发仪蒸干，加入PBS缓冲液，移液到离心管中，并将离心管内的空气置换为惰性气体，震荡，超声破碎，静置，浮集上层微球即所制生物素化纳米微泡；(3)合成生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸：在弱碱性溶液中，在硼氢化钠作用下，通过还原氨化法进行半乳糖与多聚赖氨酸共价连接，化学合成半乳糖基化的人工配体G‑PLL，利用透析袋对G‑PLL反应液进行透析，并用Molish反应检测透析液中未反应的乳糖，透析至Molish反应阴性，透析结束，透析液于干燥箱内干燥至白色结晶析出，得纯化的配体G‑PLL，将G‑PLL与BNHS混匀后室温反应2小时，透析即得生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸；(4)通过生物素‑亲和素系统将上述步骤的生物素化NET‑1 siRNA、生物素化纳米微泡和生物素化半乳糖基化多聚赖氨酸偶联，即得携NET‑1 siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。