[发明专利]一种丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法，属于抗体制备技术领域。所述方法包括丙烯酰胺抗原的制备和丙烯酰胺单克隆抗体的制备。所述抗原包括半抗原、免疫原和包被原，所述单克隆抗体制备包括动物免疫、细胞融合与克隆、单克隆抗体的腹水制备和纯化的步骤。本发明制备方法简单，免疫效果好；能够高效、稳定分泌抗丙烯酰胺单克隆抗体，该抗体具有效价高、特异性强、成本低廉的特点。

主权项

1.一种丙烯酰胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的单克隆抗体用于油炸食品中丙烯酰胺的免疫检测；具体的制备方法步骤如下，/n第一步，丙烯酰胺抗原的制备；/n(1.1)半抗原的合成；/n10ml的烧瓶中加入92.4mg的NaHCO₃，4ml的水，完全溶解后加入硼砂38.14mg，间巯基苯甲酸154.19mg，丙烯酰胺84.1mg，40℃反应2小时；1M盐酸调pH＝5～6，析出白色固体，过滤，水洗滤饼，干燥得200mg产物，即丙烯酰胺半抗原；半抗原具体的合成方法如下：/n /n(1.2)免疫原的合成；/n称取丙烯酰胺半抗原6.6mg溶于2ml DMF，加入10.2mg NHS和11.4mg EDC，室温搅拌2h；50mg KLH，66mg碳酸氢钠溶于6ml水，冷水浴中将活化药物逐滴加入蛋白，室温搅拌24h，将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋，1L pH7.2的PBS透析3天，放置在4℃搅拌透析，每天换液3次，共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，得到免疫原；半抗原的羧基通过NHS，EDC活化后与KLH的氨基缩合形成酰胺键，从而形成稳定的人工抗原——免疫原；/n(1.3)包被原的合成，具体的合成方法如下：/n半抗原的羧基通过NHS，EDC活化后与BSA的氨基缩合形成酰胺键，从而形成稳定的包被原:称取丙烯酰胺半抗原6.6mg溶于2ml DMF，加入10.2mgNHS和11.4mg EDC，室温搅拌2h；50mg BSA，66mg碳酸氢钠溶于6ml水，冷水浴中将活化药物逐滴加入蛋白，室温搅拌24h，将反应产物装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋，1L PBS透析3天，放置在4℃搅拌透析，每天换液3次，共计换液9次，将透析产物4500rpm离心6min，得到包被原；/n第二步，丙烯酰胺单克隆抗体的制备；/n包括如下步骤：/n(2.1)动物免疫；/n用无菌pH7.0的PBS液将合成的免疫原溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂体积按1:3的比例充分乳化制成油乳剂疫苗；首次免疫用弗氏完全佐剂，对8～10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为112μL/只；14天后二免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量56μL/只；以后4次免疫同二免；6免后加强免疫，不加佐剂，直接采用AM-KLH和生理盐水免疫；/n(2.2)细胞融合与培养；/n将产生丙烯酰胺特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1体积比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清液，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入1ml融合剂，融合剂为聚乙二醇0.8mL，轻轻混匀细胞，静置90S，加入DMEM无血清培养基终止反应，加入速度为前2min 1ml/min，第3min 2ml/min，第4min 5ml/min，此时即可将剩余DMEM倒入离心管，终体积为25～30ml，800rpm离心7min，弃去上清液；用20～50ml HAT培养基重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔150μl；置37℃,二氧化碳体积浓度5％的培养箱中培养；/n(2.3)细胞筛选与亚克隆；/n待细胞长至孔底面积的1/2～1/3时，采用直接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔；将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌丙烯酰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株；/n(2.4)单克隆抗体的腹水制备和纯化；/nA.小鼠致敏：液体石蜡致敏Balb/c小鼠，6～8周，注射体积500μl/只；7天后制备腹水；/nB.注射细胞：收集杂交瘤细胞并用DMEM洗细胞两遍，取10⁵～10⁶个细胞注射于小鼠腹腔，一周后小鼠状态不活跃并且小鼠的腹腔肿大；/nC.腹水采集：注射细胞5天后对腹腔肿大的小鼠用无菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，这样多次反复采集直到小鼠自然死亡；/nD.腹水纯化：采集到的腹水，在使用前经过0.01mol/L NaCl于4℃环境下透析；然后用辛酸-饱和硫酸铵法粗纯化，亲和层析法进行纯化，纯化后的腹水放入-20℃环境保存，腹水在使用前经过0.01mol/LNaCl于4℃环境下透析48h，中间每隔6～8h换液一次。/n