[发明专利]一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用

摘要

本发明公开一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNA Array v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA；构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果。并采用干扰lncRNA使其表达发生下调继而通过调控心肌细胞内自噬水平从而达到保护心肌缺氧再复氧损伤的目的。因此提出了通过调控lncRNA保护心肌细胞缺氧再复氧损伤，对进一步研究心肌缺血再灌注相关的lncRNA在预测以及防治心肌梗死的具有重要的意义。

主权项

1.一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型，采用Rat LncRNA Array v2.0芯片筛选出心肌细胞缺氧再复氧过程中差异表达的lncRNA；具体过程为：步骤1.1、心肌细胞缺氧再复氧处理及正常细胞处理：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；步骤1.2、直接在培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次；在TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；向所述上层水相中加入等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，‑80℃保存备用；提取上述两组细胞总RNA，用Agilent公司的快速Amp标记试剂盒标记RNA，与芯片上的探针杂交；步骤1.3、收集芯片的数据，用Agilent GeneSpring GX v12.0软件分析数据，筛选出变化倍数大于1.5倍，P值小于0.05的差异表达的lncRNA；步骤2、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型和langendorff离体心脏缺血再灌注模型，采用实时定量PCR验证芯片的结果；具体过程为：步骤2.1、构建体外心肌细胞缺氧再复氧模型：将心肌细胞株H9c2置于无糖DMEM无FBS的细胞培养液中，分别放入低氧培养箱培养1小时，然后再将两组细胞放入常氧培养箱进行复氧2小时，建立心肌细胞缺氧再复氧损伤的心肌细胞模型，正常组细胞在常氧培养箱中培养3小时；其中，低氧培养箱为<1％O2、5％CO2、约95％N2；常氧培养箱为21％O2、5％CO2、74％N2；步骤2.2、构建langendorff离体心脏缺血再灌注模型：将280‑300g的SD雄性大鼠麻醉后开胸腔取出的心脏的主动脉与仪器的灌流针口连接后灌注K‑H液，待心脏复博后将自制心室内压球囊测压管送入左心室，此后稳定20分钟，心律齐，心率≥220次/分，且左室收缩压≥60mmHg再进行后续实验；其中对照组持续灌流150分钟，缺血再灌注组全心停灌30分钟后再灌120分钟，实验结束后收集心脏组织样本，放‑80℃备用；步骤2.3、将步骤2.1中经缺氧再复氧处理后的细胞中加入1ml TRIZOL试剂裂解，裂解时用枪吸打几次；每50‑100mg组织样品，加入1ml的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆；所加样品体积不能超过匀浆此样品所使用的TRIZOL试剂体积的10％；在上述的TRIZOL中加入0.2ml氯仿，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟，4℃下，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入新的无RNA酶离心管中；加入与上述上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，然后4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；在上述沉淀中加入质量分数为75％的乙醇1ml，颠倒数次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清；再次4℃下12000rpm离心2分钟；弃上清，室温下干燥1～2分钟，加20μl无RNA酶水溶解，得到RNA提取液，‑80℃保存备用；采用RNA抽提试剂提取正常大鼠心肌组织以及缺血再灌注处理后大鼠心肌组织总的RNA，用逆转录试剂对RNA提取液进行逆转录反应得到cDNA；步骤2.4、对步骤2.3中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测扩增结果。