[发明专利]促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法

摘要

本发明公开了一种促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法，属水产养殖领域。传统上微拟球藻采用开放型跑道式大池培养，生长慢，操作麻烦，易污染，高不饱和脂肪酸含量低。本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在光照培养箱中进行，提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段在微藻培养室中采用塑料薄膜袋充气培养，提高了温度和光照，有利于高不饱和脂肪酸积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了人尿，KBr，H3BO3，烟酸，盐酸吡哆醇，土壤浸出液等，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，高不饱和脂肪酸含量提高140％。

主权项

1.一种促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法，其特征在于具体步骤如下：步骤1)培养液的配制培养液成分：NaCl25份，NaNO31.5份，过磷酸钙0.3份，NH4Cl1.2份，FeC6H5O70.01份，MgSO4·7H2O5份，人尿1.5份，KBr0.02份，H3BO30.01份，生物素0.001份，烟酸0.01份，盐酸吡哆醇0.02份，羊粪浸出液2份，土壤浸出液1.2份，煮沸冷却后的海水1000份； 取此培养液2000毫升装入一3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4℃冰箱保存备用；步骤2)光照培养箱培养取一3000毫升洁净的三角烧瓶，加入步骤1所述培养液1800毫升，用生长旺盛、无污染、指数生长期的微拟球藻藻种接种，接种密度每毫升3万个细胞，轻轻摇匀，报纸和橡皮筋封口，放入光照培养箱中培养，调节温度至25℃，光照强度4500lux，光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗，每天手动摇瓶3次，每次45秒钟，培养至第6天，调节温度至27℃，光照强度6000lux，培养至第11天，转入下一步骤；步骤3)塑料薄膜袋充气培养取一可装水400升的塑料薄膜袋，装入步骤1所述的培养液200升，加入步骤2培养至第11天后的藻液1800毫升，扎紧袋口，充气培养，袋口插入2根管子，一根为塑料管，长3米，直径8毫米，一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分＝空气96％+纯CO24％，连续不间断充气，以藻细胞浮起不下沉；另一根较短，长30厘米，直径10毫米，为比较硬的料管，顶端露出袋口，用以排气；将此塑料袋放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，光暗周期＝14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时光照，10小时黑暗，调节温度至30℃，光照强度12000lux，连续培养9天后，停止培养，转入下一步骤；步骤4)藻细胞采收：将培养后的藻液加入到离心机中，离心5分钟，离心机转速6000转/分钟，弃上清液，得绿色的粘稠藻泥，采收完毕；步骤1中所述土壤浸出液制备方法：取树林中松散、富含有机质的上层土壤1千克，加自来水5升，煮沸20分钟，将泥浆倒入烧杯中，静置24小时，后吸取上清液，倒入三角烧瓶中，加棉花塞，煮沸15分钟，冷却，静置沉淀12小时，取上清液即得土壤浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，贴上标签，置于4℃冰箱备用；步骤1中所述FeC6H5O7较难溶解，加少量自来水在火炉上微热至80‑90℃，并不断搅拌至全部融化；步骤1中所述羊粪浸出液制备方法：将羊粪堆积在阳光下，适当暴晒，使羊粪含水量在50‑75％，用黄泥或塑料薄膜密封发酵，春秋季需一个月，夏季半月；发酵好之后，要先将其稍晾；取发酵好的羊粪1000克，置入大小适当的瓷缸，加水10升，充分搅拌15分钟，静置72小时，取上清液4升，煮沸10分钟，冷却，静置48小时，取上清液2升备用；步骤1中所述人尿制备方法：取一3000毫升三角烧瓶，装入人尿1500毫升，静置，自然发酵48小时，放在电炉上加热，煮沸3分钟，冷却，装入磨口塞棕色试剂瓶，密封，置于4℃冰箱冷藏备用；步骤2中接种用的微拟球藻预先进行提纯，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；步骤1中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；步骤1中各种无机营养盐和维生素预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过30天；步骤1和2中所用三角烧瓶玻璃仪器均需洗刷干净放在70℃烘箱中烘干后使用；步骤2所述接种过程需在上午9‑10点且在无菌操作台上进行；步骤2中所用塑料薄膜袋要求较厚且质地坚韧，下面铺一层破旧毛毯或床单，以防划破；步骤1中所用化学药品纯度均需化学纯级别。