[发明专利]一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法

摘要

本发明公开了一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，步骤如下：去冷沉淀人血浆层析，S/D病毒灭活，第二次亲和层析：超滤；除菌过滤；20nm纳滤膜过滤去除病毒；分装；冻干：干热病毒灭活。本发明方法制得的AT-Ⅲ制品质量稳定可靠，安全，同时，本发明方法的收率高达25％，具有良好的市场应用前景。

主权项

一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶‑Ⅲ的方法，其特征在于：步骤如下：(1)去冷沉淀人血浆层析先将人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT‑Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4℃～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT‑Ⅲ浓缩液；(2)S/D病毒灭活对步骤(1)中所得AT‑Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15M～0.25M，体积不变；按步骤(1)最终所得液体体积的10％，加入11％S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时；11％S/D病毒灭活液含吐温‑80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每110g吐温‑80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；(3)第二次亲和层析对经S/D灭活后的溶液，过0.45μm膜预过滤，然后泵入第二根肝素亲和层析柱中进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT‑Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～25℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；②上样：将步骤(2)S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT‑Ⅲ原液；(4)超滤对步骤(3)中所得AT‑Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.11M～0.22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加冻干保护剂，所述保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6％～1.6％；(5)除菌过滤；(6)20N纳滤膜过滤去除病毒；(7)分装；(8)冻干：①分装后的制品常温入柜；②将隔板温度在40分钟内快速降至‑40℃，保持3小时；③开启真空泵，真空度控制在7Pa～15Pa；④2小时后将隔板温度升至‑30℃，保持3小时；⑤4小时后隔板温度升至‑20℃，保持6小时；⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；⑧真空压塞出柜；(9)干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min；步骤(1)和步骤(3)中：平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09M～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3M～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2M～3M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；以上百分比浓度除特别说明外均为质量百分比以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。