[发明专利]一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法

权利要求书

1.一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)去冷沉淀人血浆层析

先将人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4℃～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；

①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；

②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；

③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；

④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ浓缩液；

(2)S/D病毒灭活

对步骤(1)中所得AT-Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15M～0.25M，体积不变；按步骤(1)最终所得液体体积的10％，加入11％S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时；

11％S/D病毒灭活液含吐温-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；

(3)第二次亲和层析

对经S/D灭活后的溶液，过0.45μm膜预过滤，然后泵入第二根肝素亲和层析柱中进行第二次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～25℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；

①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；

②上样：将步骤(2)S/D病毒灭活最终所得液体泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附；

③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；

④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ原液；

(4)超滤

对步骤(3)中所得AT-Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.11M～0.22M，并适当浓缩使每毫升溶液中的活性单位大于50IU，添加冻干保护剂，所述保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6％～1.6％；

(5)除菌过滤；

(6)20N纳滤膜过滤去除病毒；

(7)分装；

(8)冻干：

①分装后的制品常温入柜；

②将隔板温度在40分钟内快速降至-40℃，保持3小时；

③开启真空泵，真空度控制在7Pa～15Pa；

④2小时后将隔板温度升至-30℃，保持3小时；

⑤4小时后隔板温度升至-20℃，保持6小时；

⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；

⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；

⑧真空压塞出柜；

(9)干热病毒灭活，干热温度100℃，时间为30min～60min；

步骤(1)和步骤(3)中：

平衡液含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.09M～0.15M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5，其余为水；洗涤液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为0.3M～0.5M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

洗脱液中含氯化钠和柠檬酸钠，其中氯化钠浓度为2M～3M，柠檬酸钠浓度为0.015M～0.025M，pH为6.5～7.5；其余为水；

以上百分比浓度除特别说明外均为质量百分比以上需要调节pH的地方，所用酸碱均为0.1M盐酸和0.2M氢氧化钠。