[发明专利]一种从人血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法

说明书

技术领域

本发明属生物制药领域；涉及一种从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法。 

背景技术

人抗凝血酶-Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，简称AT-Ⅲ)为单肽链α糖蛋白，分子量约58kD(千道尔顿)，由423个氨基酸组成，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体血浆中的抗凝作用占整个抗凝作用的70％左右，其半衰期为2.69天，患病时半衰期缩短，其主要在肝脏合成，故在各种肝脏疾病发生时AT-Ⅲ有不同程度的获得性缺乏。AT-Ⅲ制品主要用来治疗先天性遗传性抗凝血酶-Ⅲ缺乏，AT-Ⅲ缺乏症为常染色体显性遗传，据统计，该症在欧美的发生率为0.2％～0.5％。AT-Ⅲ制品还用来治疗获得性抗凝血酶Ⅲ缺乏，见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等，以及各种病因引起的DIC综合症，产科与外科手术等造成的血栓等。 

上世纪60～70年代即开始有人报道纯化AT-Ⅲ的工艺，但是仅限于实验室开发。1972年Heimburger et al首次分离并鉴定AT-Ⅲ为a2单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2％左右。1974年Maggie Miller-Andersson et al使用肝素亲和胶从血浆中纯化AT-Ⅲ，然后经过DEAE-Sephadex and Sephadex G200层析处理,其活性回收率为34％，纯度在90％以上。1979年,Wicker et al首先叙述了工业规模制备临床用途的AT-Ⅲ浓缩物,其原料为工业生产丢弃的Cohn组分IV-1沉淀。1989年,Hoffman等报道了大量制备AT-Ⅲ的方法，原料为Cohn氏工艺组分IV-1,通过肝素亲和层析与其它蛋白分离，之后,在0.5M枸椽酸钠溶液中将AT-Ⅲ浓缩物于60℃加热10小时,以灭活乙肝病毒和其他传染性病毒,以后,再进行二次肝素亲和层析,成品比活不低于6.4IU/mg,纯度大于95％,冻干后4℃存放2年,仍有90％以上的生物学活性。1994年,W ytold等发表了以重溶后Cohn氏组分IV-1沉淀为原料,进行人血浆AT-Ⅲ肝素亲和层析的大规模提纯改良法,该工艺包括了病毒灭活的加热过程和为进一步提纯目的的第二步肝素亲和层析,上述方法可在5小时内在40升柱上通过1800升的原液。AT-Ⅲ成品纯度达95％以上,其平均效率为69％,比活性为7.7IU/mg蛋白,由20kg FIV-1沉淀获得30g AT-Ⅲ,效果达15～20％。90年代以后，国外血液制品企业开始推出新的血浆分离纯化工艺，层析技术被广泛应用，直接以去冷沉淀血浆为 原料进行亲和层析制备AT-Ⅲ的技术得到应用和推广，如法国的FBL公司等都采用此工艺进行制备AT-Ⅲ制品。另外，为了去除难以采用S/D、加热等方法灭活的人细小病毒(B19)，国际上相关制品都加以纳米膜过滤步骤来去除，本步骤采用过滤的方式将制品溶液中可能含有的包括细小病毒B19在内的病毒去除掉，去除能力达到4个Log以上，提高了制品的病毒安全性。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备人免疫球蛋白的方法。 

本发明从人去冷沉淀血浆中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的方法，步骤如下： 

(1)去冷沉淀人血浆层析 

先将人去冷沉淀血浆用0.45μm膜预过滤，然后泵入第一根肝素亲和层析柱中进行第一次亲和层析，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT-Ⅲ浓缩液，而流穿的血浆将继续用于生产其他制品；其中层析温度范围为4℃～15℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积； 

①平衡：用平衡液对亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积； 

②上样：将预处理的人去冷沉淀血浆泵入层析柱中，通过亲和胶进行吸附； 

③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤； 

④洗脱：对亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT-Ⅲ浓缩液； 

(2)S/D病毒灭活 

对步骤(1)中所得AT-Ⅲ浓缩液用10kD孔径超滤膜超滤除盐，将盐浓度降至0.15M～0.25M，体积不变；按步骤(1)最终所得液体体积的10％，加入11％S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时； 

11％S/D病毒灭活液含吐温-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制； 

(3)第二次亲和层析