[发明专利]在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用

摘要

本发明涉及一种在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用，属于农业生物技术领域。本发明提供了选用棉铃虫能量代谢关键酶基因——精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫方法。本发明具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体及其在沉默目的基因中的应用。所述载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK基因的dsRNA的转基因植物。通过将转基因植株与野生型植株对比显示：取食这种转基因植物可影响棉铃虫的生长发育。

主权项

1.一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体，其特征在于：HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，其中两个HaAK基因片段之间包含一个gus linker fragment，所述的HaAK是棉铃虫的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均为从棉铃虫中克隆获得的HaAK的全长cDNA序列；所述RNAi载体的构建包括如下步骤：(1)以克隆获得的棉铃虫HaAK基因序列为基础，设计特异性正向引物F2：5'‑CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT‑3'，以R1：5'‑TTACAGCGACTTCTCAATT‑3'为反向引物，用Prime STAR HS DNA聚合酶对质粒pMD18‑HaAK进行PCR扩增；扩增反应体系为：5×Prime STAR HS DNA聚合酶0.25μL，5×Prime STAR Buffer2.5μL，dNTPs 2μL，引物F2/R 1各1μL，模板pMD18‑HaAK 0.5μL，补ddH2O至25μL；扩增条件为：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；(2)回收扩增获得的平末端PCR产物，并将其与pENTR/D‑TOPO载体进行TOPO定向克隆，获得pENTR/D‑HaAK；(3)转化大肠杆菌菌株E.coli TOP 10感受态细胞，筛选抗Kan菌落，同时进行菌液PCR鉴定和测序分析；(4)以克隆的入门载体pENTR/D‑HaAK为基础，进行LR反应，LR反应体系如下：TOPO入门载体1μL，pANDA 35HK载体质粒3μL，LR反应酶0.5μL；瞬时离心，25℃过夜，加0.5μLProteinase K，37℃10min终止反应，构建出针对于HaAK靶标基因功能区域片段的RNAi载体pANDA35HK‑dsHaAK。