[发明专利]一种菜豆直接再生体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，主要包括菜豆无菌苗的获得方法、直接再生培养基配方、生根培养基配方、组培苗移栽方法等，针对现有技术中菜豆组织培养体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明通过筛选各种功能培养基中不同激素种类及其配比，最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用奠定基础。

主权项

一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）菜豆无菌苗的获得：挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%‑30%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时10‑20min，并每隔1‑2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水清洗4‑5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度20℃‑25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；（2）直接再生培养基配方及操作方法：将萌发5‑6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5‑3.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3‑4mm，深度0.3‑0.5mm；将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度20℃‑25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔5‑10天更换一次，15‑20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB₅+ 6‑BA 1.0‑6.0 mg/L+IAA 0.1‑1.0 mg/L+活性炭10‑50mg/L；（3）再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4‑5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB₅+ IBA 0.1‑1.0 mg/L+活性炭5‑30mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20‑25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7‑10天顺利生根；（4）组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3‑5天，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25‑28℃，相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去；（5）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。