[发明专利]一种菜豆直接再生体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及以菜豆子叶节为外植体，获得高频、高效的菜豆直接再生体系的方法。

背景技术

菜豆[Phaseolus vulgaris L.]又称芸豆，四季豆，玉豆、扁豆等，属豆科菜豆属菜豆种植物。菜豆起源于中南美洲的热带地区，主要分布于墨西哥南部和中美洲，15世纪经美洲引入我国。通过不断的演化和变异，出现了以嫩荚供食用的软荚菜豆，因此中国被认为是菜豆的次级起源中心，在中国已有500多年的栽培历史。菜豆在我国各省市均有栽培，面积十分广泛。据联合国粮农组织统计（FAO，2012年），中国粒用菜豆总栽培面积为1456.5万亩，食荚菜豆栽培面积为939万亩。栽培面积仅次于巴西和印度，位居世界第三。

菜豆是严格闭花授粉作物，繁种过程中种性退化严重。加上人工杂交成功率低，知识产权无法保护，因此菜豆品种更新极为缓慢。种性退化对产量和商品性影响很大，菜农急需新品种更新。随着分子生物学和植物基因工程的发展，人们开始借助生物技术手段建立高频、高效的菜豆再生体系并对其进行遗传转化，可大幅度缩短育种周期，提高育种效率。

发明内容

本发明公开的一种菜豆直接再生体系的建立方法，针对现有技术中菜豆组织培养体系技术方案不完整、不明确，甚至方法本身重复再现性差的缺陷，本发明提供了一种以菜豆子叶节为外植体建立高频、高效再生体系的方法。

本发明目的是在基础培养基的基础上，通过筛选培养基中不同激素种类及其用量的配比（筛选的培养基包括再生培养基和生根培养基，再生培养基激素包括6-BA，用量在1.0mg/L-6.0mg/L；IAA，0.1 mg/L-1.0mg/L。生根培养基激素是IBA，用量为0 mg/L-1.0mg/L）最终建立高频、高效的菜豆直接再生体系的方法，为菜豆组培快繁及转基因育种的应用奠定基础。

为实现上述目的，本发明公开了一种菜豆直接再生体系的建立方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）菜豆无菌苗的获得方法：

挑选籽粒均匀、饱满的菜豆种子，置于玻璃容器内，将浓度为10%-30%的次氯酸钠溶液缓缓倒入容器内，使菜豆种子完全浸泡在次氯酸钠溶液中，整个消毒过程用时10-20min，并每隔1-2min搅拌一次，使种子表面与溶液充分接触，以保证消毒彻底，消毒后的菜豆种子用无菌水清洗4-5次，整个消毒过程在超净工作台内完成；将清洗后的菜豆种子插入萌发培养基内，种子插入一半即可，种子萌发环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；

（2）直接再生培养基培养基配方及操作方法：

将萌发5-6天的菜豆无菌苗在超净工作台中取出，放在灭菌后的培养皿里，切除顶端生长点及胚根，留下子叶节上下各1.5-3.5mm的下胚轴，顺着下胚轴将外植体纵向平均分开，得到两个对称的带子叶的子叶节，用刀片对纵切面进行划伤，伤口长3-4mm，深度0.3-0.5mm；将处理好的外植体近轴面向上与培养基成45度角斜插入芽诱导培养基中，密封并置于培养室中培养，培养环境为温度20℃-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗；培养基每隔5-10天更换一次，15-20天后可获得再生植株；所述的芽诱导培养基指的是：MSB₅+ 6-BA 1.0-6.0 mg/L+IAA 0.1-1.0 mg/L+活性炭10-50mg/L；

（3）再生芽的生根培养基配方及操作方法：将长到4-5cm的不定芽延基部从外植体上切下，插入1/2MSB₅+ IBA 0.1-1.0 mg/L+活性炭5-30mg/L生根培养基内，密封好后置于培养室内培养，培养环境为温度20-25℃，光周期为16h/8h光照/黑暗，7-10天顺利生根；

（4）组培苗的移栽方法：生根后的组培苗，在培养室内开盖炼苗3-5天，然后移栽到装有基质的营养钵内，将移栽好的组培苗放在塑料拱棚内生长，保证拱棚内的温度25-28℃，相对湿度60%，拱棚内生长5天逐渐给拱棚放风，直至幼苗适应温室环境，再将拱棚撤去；

（5）成活的组培苗便可移栽入露地进行正常管理。

本发明所述的菜豆直接再生体系的建立方法，其中的菜豆品种指的是双丰3号。

本发明更进一步公开了菜豆直接再生体系的建立方法在提高菜豆生芽率、生根率、植株成苗率方面的应用。实验结果表明：菜豆直接再生体系的建立方法易于诱导再生芽，

再生芽率提高、生根率提高，再生植株成苗率提高。直接再生周期短，直接再生易于操作，重现性好。

本发明建立的菜豆直接再生体系其中的关键在于：