[发明专利]一种鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重组蛋白的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重组蛋白的制备方法及其应用，制备方法包括下列步骤：（1）鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的特异性引物设计与合成；（2）RT-PCR扩增和重组表达质粒的构建；（3）重组质粒的诱导表达及表达产物的鉴定；（4）表达产物的纯化和Westernblot活性检测。本发明制备的重组蛋白具备良好的抗原性，可以用于检测鸭甲肝病毒，也可以用来制备鸭甲肝病毒抗体上的应用。

主权项

 一种鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的特异性引物引物设计与合成：上游引物VP1M‑F: 5'–CGGAATTCACACCACTCAGGCCAACTC–3'；下游引物VP1M‑R: 5'–CCGCTCGAGTTCAATTTCCAGATCGAGTTC–3'，下划线部分分别为添加的EcoR I 和Xho I酶切位点；（2）RT‑PCR扩增和重组表达质粒的构建；（3）重组质粒的诱导表达及表达产物的鉴定；（4）表达产物的纯化和Western blot活性检测；根据权利要求1所述的鸭甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重组蛋白的制备方法，其特征在于，RT‑PCR扩增和重组表达质粒的构建的具体步骤为：根据Trizol试剂的使用说明提取200μL DHAV 鸭胚尿囊毒中的总RNA；以提取的总RNA和随机引物N6或VP1M‑R进行反转录获得cDNA作为PCR模板；反转录程序为：42℃反应60min，95℃反应5min灭活逆转录酶；PCR反应采用50μL反应体系：cDNA模板 4μL，上下游引物(VP1M‑F和VP1M‑R) 各2.5μL，2×Pfu PCR MasterMix 25μL，ddH₂O 16μL；反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min；反应结束后取6μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析；分析正确后，其剩余PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收；    将回收的PCR产物与载体pGEX‑4T‑1分别用EcoR I和Xho I双酶切，回收纯化，用T4 DNA 连接酶于16℃连接过夜，将连接产物转化Trans DH5α感受态细胞；挑取单菌落培养后提取质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确后测序进一步确证，获得阳性重组质粒命名为pGEX‑4T‑VP1M。