[发明专利]一种基于高通量测序的SNP检测方法

摘要

本发明公开了一种基于高通量测序的SNP检测方法。本发明的方法包括如下步骤：探针设计、预扩增及biotin标记、杂交、连接、Barcode特异性引物扩增、测序、根据测序结果来分析样品的SNP位点信息。本发明的实验证明，本发明的方法具有如下优点：(1)提高了体系的灵敏度、(2)样品标记简单、(3)排除了预扩增中的非特异扩增产物的影响利于数据分析、(4)建库方法简单、(5)降低了模板随机突变的概率、(6)极大的降低测序成本、(7)数据分析容易、(8)位点选择灵活，非常适合中等数量的突变位点进行大规模样本筛查。

主权项

一种基于高通量测序检测待测样本中突变位点的方法，包括如下步骤：1)针对已知突变位点所在的靶序列设计检测探针和预扩增引物对，所述突变位点为SNP位点、插入突变位点和/或缺失突变位点；所述检测探针为1个或多个用于检测SNP位点的检测探针A和/或1个或多个用于检测插入或缺失突变位点的检测探针B；所述每个检测探针A或每个检测探针B对应一个所述突变位点；所述用于检测SNP位点的检测探针A由上游位点分型探针ASO‑A和下游位点特异探针LSO‑A组成，且所述ASO‑A探针和所述LSO‑A探针的延伸方向相同；所述ASO‑A的3’端与SNP野生型碱基所在靶序列或SNP突变位点碱基所在靶序列相同或互补；所述ASO‑A的3’末端碱基与所述SNP野生型碱基或所述SNP突变位点碱基相同或互补；所述ASO‑A探针的5’端游离于所述SNP野生型碱基所在靶序列或所述SNP突变位点碱基所在靶序列之外，且为通用探针P1；所述SNP突变位点每个突变形式对应一条ASO‑A探针；所述LSO‑A探针的5’端与所述SNP野生型碱基所在靶序列或SNP突变位点碱基所在靶序列相同或互补，且其5’末端碱基与所述SNP野生型碱基所在靶序列或SNP突变位点碱基所在靶序列按照探针延伸方向SNP位点下游第一个紧邻碱基相同或互补，且5’末端碱基磷酸化，所述LSO‑A探针3’端游离于所述靶序列之外且为通用探针P2；所述用于检测插入/缺失突变位点的检测探针B由1条用于检测插入/缺失突变位点的上游位点分型探针ASO‑B、1条用于检测野生型位点的上游位点分型探针ASO‑B和1条下游位点特异探针LSO‑B组成，且3条探针的延伸方向相同；所述用于检测插入/缺失突变位点的上游位点分型探针ASO‑B为用于检测插入突变位点的上游位点分型探针ASO‑B或用于检测插缺失突变位点的上游位点分型探针ASO‑B；所述用于检测插入突变位点的上游位点分型探针ASO‑B的3’端与插入突变位点所在的靶序列相同或互补，且其3’末端碱基与所述插入突变位点序列的最后一位碱基相同或互补；所述用于检测缺失突变位点的上游位点分型探针ASO‑B的3’端与缺失突变位点所在的靶序列相同或互补，且其3’末端碱基与所述野生型位点所在靶序列上缺失突变位点序列中第一位碱基的上游紧邻碱基相同或互补；所述插入/缺失突变位点所在的靶序列为所述野生型位点所在的靶序列的第n个碱基前插入或者缺失突变位点得到的序列；所述用于下游位点特异探针LSO‑B的5’端与所述野生型位点所在的靶序列相同或互补，且其5’末端碱基与所述野生型位点所在的靶序列沿探针延伸方向第n位碱基相同或互补；所述LSO‑B探针的3’端游离于所述野生型位点所在的靶序列之外且为通用探针P2；每个突变位点的每条所述上游位点分型探针ASO与其对应的下游位点特异探针LSO均可无间隙、非重叠拼接为该突变位点对应的目的靶序列反向互补序列；所述预扩增引物对为1个或多个预扩增引物对，所述预扩增引物对为能够扩增出1个或多个突变位点所在靶序列的引物对；且每个所述预扩增引物对中的一条引物的5’端标记biotin；2)用1个所述预扩增引物对或多个所述预扩增引物对待测样本进行预扩增，得到biotin标记核酸；3)用一个所述检测探针A、多个所述检测探针A的混合物、一个所述检测探针B和/或多个所述检测探针B的混合物与所述biotin标记核酸杂交，得到杂交产物；4)用DNA连接酶连接所述杂交产物，得到测序靶序列；5)用Barcode特异性引物和Common primer引物对测序靶序列进行扩增、高通量测序，得到测序靶序列扩增产物的测序结果；所述Barcode特异性引物和Common primer引物的3’端20个碱基分别与所述通用探针P1和所述通用探针P2互补；所述Barcode特异性引物中含有用于区分样本的Barcode序列XXXXXX，该序列为A、T、C和G随机组合的6碱基，根据不同的组合方式确定不同的样本；6)分析所述测序结果，确定待测样本是否含有该突变位点或确定该突变位点的基因型。