[发明专利]悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法

摘要

悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲细胞来生产金线莲生物碱的方法。本方法首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中未分化的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块生长，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高金线莲生物碱产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。

主权项

悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，其特征在于，是一种利用细胞培养反应器对金线莲细胞培养，添加植物生长调节剂和生物酶制剂激活细胞生长并缩短细胞培养周期，来生产金线莲生物碱的方法，具体步骤为： （1）单细胞制备取金线莲蒴果消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；（2）单细胞系培养将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000‑3000lux，色温为4000‑6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2℃，当细胞密度达到10000‑20000个/mL，即可放大培养；（3）细胞群放大培养 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵罐中，培养基中加入：NAA 0.1‑2mg/L，6‑BA 0.1‑2mg/L，果胶酶50‑100mg/L，纤维素酶10‑50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000‑3000lux，色温为4000‑6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4； （4）当细胞密度达到60000‑80000个/ml 即可停止培养，时间为15‑18天，采用低速离心或过滤法收集金线莲细胞，再常规方法提取金线莲生物碱。