[发明专利]悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物碱生产技术，尤其涉及金线莲生物碱的生产技术，具体为一种采用细胞培养法生产金线莲生物碱的方法。

背景技术

金线莲生物碱类化合物是金线莲的主要成分之一，金线莲对支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、急慢性肝病、高血压、动脉硬化、脑血栓等均有辅助功效。金线莲生物碱的药理作用主要表现在消炎、解毒、护肝、预防心血管疾病的作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统金线莲生物碱的提取方法是用金线莲属植物的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对金线莲精深加工的需求。

随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产金线莲生物碱的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养金线莲细胞生产金线莲生物碱的研究还没有报道，因此开发一种高效生产金线莲生物碱类天然产物的方法是十分有意义的。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种利用气升搅拌罐悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，以解决上述背景技术中的研究空白。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现，悬浮培养细胞生产金线莲生物碱的方法，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲单细胞系群来生产金线莲生物碱的方法，培养基中添加植物生长调节剂和生物酶制剂来激活细胞生长并缩短细胞培养周期，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。具体步骤见如下阐述：

（1）单细胞制备

取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用50-80 微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；  

（2）单细胞系培养：

将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000-3000lux，色温为4000-6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2℃，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养；

（3）细胞群放大培养：

将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵罐中，培养基中加入：NAA (1-Naphthaleneacetic acid，萘乙酸) 0.1-2mg/L，6-BA （6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤） 0.1-2mg/L，中性果胶酶50-100mg/L，中性纤维素酶10-50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000-3000lux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4； 

（4）当细胞密度达到60000-80000个/ml 即可停止培养，时间为15-18天，采用低速离心或其他方法收集金线莲细胞，再常规方法提取金线莲生物碱。

本发明工艺技术优点

本发明中，首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧供应均匀、充分，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。 

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明的权利要求，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

具体实施例1

1、培养阶段

（1）单细胞制备

取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体 培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80 微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；