[发明专利]小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)上的应用

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及一种鸟氨酸脱羧酶(ODC)的小分子抑制剂及其应用；通过计算机辅助的高通量药物筛选，发现针对鸟氨酸脱羧酶(ODC)的新型小分子抑制剂，验证其效果，发现对ODC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源ODC，预防、治疗和诊断肿瘤疾病、病原微生物感染，研发制备肿瘤药物或病原微生物感染类药物。

主权项

一种筛选具有抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性的小分子抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)ODC原核表达质粒的构建将ODC的基因序列，通过BamH I和Xho I酶切位点，插入到pET28a质粒中，构建出pET28a‑hODC质粒，经DNA测序验证；2)ODC蛋白的表达将步骤1)构建的pET28a‑hODC质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过卡那霉素进行筛选，然后将在含有卡那霉素的Luria‑Bertani培养板上生长的菌株，接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm培养至对数生长期，再添加异丙基硫代半乳糖苷至0.5mM，在28℃诱导表达4小时，最后，离心收集细菌；3)ODC蛋白的纯化将步骤2)中收集的细菌，用裂解液重新悬浮，然后通过超声方法进行细胞裂解，再将裂解液在4℃、12000转/min，离心后，保留上清；最后将上清利用Ni‑NTA His标签蛋白结合填料进行结合和纯化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脱缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷/HCl,pH 8.0，300mM NaCl，1mM DTT，100mM咪唑；4)ODC蛋白的活性检测在EP管中，加入400μL底物反应混合物、50μg的ODC蛋白，混匀后将EP管放置在37℃水浴中30min；加入400μL 10％的三氯乙酸终止反应，室温离心5000rpm、5min，然后取出100μL上清，与200μL 4mol/L的NaOH溶液混合，加入400μL正戊醇，充分混合，2000rpm离心5min，再将上层液200μL转移至新的EP管中，加入200μL0.1mol/LpH为8.0的四硼酸钠混合均匀、加入200μL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400μL DMSO，充分混合1min，3000rpm离心5min；最后取出上层液到96孔板中，用酶标仪检测426nm处的吸光值，得到未加酶的OD值；5)抑制剂对ODC蛋白的抑制活性的检测根据步骤4)中所述的方法，在加入400μL底物反应混合物后，随即加入鸟氨酸脱羧酶的小分子抑制剂，后续操作同步骤4)；通过以下公式计算出ODC抑制率：对照差＝加小分子抑制剂对照组平均OD值‑未加小分子抑制剂对照组平均OD值，其中对照组在步骤5)中加入的抑制剂为DFMO抑制剂；实验差＝加小分子抑制剂实验组平均OD值‑未加小分子抑制剂实验组组平均OD值；ODC抑制率＝[(对照差‑实验差)/对照差]×100％；上述方法筛选得到的小分子抑制剂的结构式为：