[发明专利]一种维生素B12核糖体开关载体的构建方法

摘要

本发明属于基因工技术程领域，涉及一种维生素B₁₂核糖体开关载体构建的方法。以Propionibacteriumfreudenreichii subsp. Shermanii菌株的全基因组为模板进行PCR扩增获得完整的核糖体开关基因序列，将其插入到p519ngfp质粒中构建重组载体p519-SWITCH-GFP。该构建的重组载体在宿主菌大肠杆菌BL21内，可以感应维生素B₁₂浓度的变化，相应调控荧光蛋白(GFP)的表达量，为维生素B₁₂的检测提供了一种新的技术支持和理论依据。

主权项

一种维生素B₁₂核糖体开关载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）根据维生素B₁₂核糖体开关RNA的保守序列，在NCBI网站上与P. freudenreichii(shermanii)菌株全基因组进行同源性比对，发现该菌株基因组上213bp的碱基序列与维生素B₁₂核糖体开关的保守序列同源性高达98%，从而确定维生素B₁₂核糖体开关的目的基因序列，维生素B₁₂核糖体开关目的基因碱基序列为：TGTACTAGGGTCAATGTGCTGGCCTCGGCCAGCGCGCGTCCGCAGCGAAGCCGGTGGGAATCCGGCACTGTCCCGCAACGGTGATGGGGCCCGGCCCCGAGTCCGGTCGACTGTGGACGTGTCCCCACATTGCCCCGGCGCAAGGTCAGCCCCACGAGCTGCCTGCGCGTGCACCGCGAAGGACGGCCCGTGGATTTGAGGTTCTTGTCCGAG；2）以P. freudenreichii(shermanii)菌株的基因组为模板，设计维生素B₁₂核糖体开关目的基因序列的上、下游引物，在上游引物引入XbaI酶切位点，下游引物引入NdeI酶切位点，通过PCR扩增获得两端带有酶切位点的完整的维生素B₁₂核糖体开关目的基因序列，获得的目的基因序列用Xba I和Nde I酶消解，目的基因片段两端露出黏性末端，PCR产物纯化试剂盒回收目的基因序列；3）用Xba I和NdeI双酶切表达荧光蛋白的p519ngfp质粒，1%琼脂糖凝胶电泳回收双酶切质粒；4）将步骤3）回收的双酶切质粒与维生素B₁₂核糖体开关目的基因序列进行连接，得到重组载体质粒p519‑SWITCH‑GFP。