[发明专利]基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法

摘要

本发明公开了一种基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，本发明首先对传统的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法进行了改进，以C17.2神经干细胞为模型，用双结合位点的方法较为准确的标定了细胞核区的TMRM非特异性吸附，提高了计算细胞静息膜电位时的精度，并在该方法基础上，通过钠离子荧光染料CoroNa Green对胞内钠离子浓度进行检测，进一步计算了钠钾离子通透性比值，从而建立了一种具有较高精度的非侵入性的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，该方法法能够对平面细胞和三维生长的细胞进行较为准确的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测。

主权项

基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A.TMRM荧光强度与浓度的关系标定将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测得的TMRM荧光强度与对应的TMRM浓度用式(1)进行拟合：F＝k[TMRM⁺]  (1)其中F为TMRM荧光强度，[TMRM⁺]为TMRM浓度；求得标定系数k；B.细胞核区TMRM的非特异性吸附标定先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞完全去极化，则细胞内外游离TMRM浓度相等，再用一系列梯度浓度的TMRM溶液分别孵育细胞，测定细胞核区TMRM荧光强度，通过式(1)计算出细胞核区TMRM总浓度，再通过式(2)计算出细胞核区非特异性结合的TMRM浓度：$\left[{\mathrm{TMRM}}_i^{+}\right]=\left[{\mathrm{TMRM}}_B^{+}\right]+\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]---\left(2\right)$其中[TMRM_i⁺]为细胞核区TMRM总浓度，[TMRM_B⁺]为细胞核区非特异性结合的TMRM浓度；为细胞核区游离TMRM浓度，其值与胞外游离TMRM浓度相等；然后，将计算出的细胞核区非特异性结合的TMRM浓度与细胞核区游离TMRM浓度用一配基两个独立结合位点的模型即式(3)进行拟合：$\left[{\mathrm{TMRM}}_B^{+}\right]=\frac{\left[{\mathrm{TMRM}}_{B\max 1}^{+}\right]\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]}{K_{D1}+\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]}+\frac{\left[{\mathrm{TMRM}}_{B\max 2}^{+}\right]\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]}{K_{D2}+\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]}---\left(3\right)$其中[TMRM⁺_Bmax1]和[TMRM⁺_Bmax2]分别为两个独立结合位点中最大非特异性结合的TMRM浓度，K_D1和K_D2分别为TMRM与两个独立结合位点的解离常数；求得[TMRM⁺_Bmax1]、[TMRM⁺_Bmax2]、K_D1和K_D2；C.基于TMRM的细胞静息膜电位检测用一定浓度的TMRM溶液孵育细胞，测定细胞核区的TMRM荧光强度，通过式(1)计算出细胞核区TMRM总浓度，将式(3)代入式(2)求解得到再通过式(4)计算出细胞静息膜电位：$V_m=-60\mathrm{lo}{g}_{10}\frac{\left[{\mathrm{TMRM}}_{\mathrm{if}}^{+}\right]}{\left[{\mathrm{TMRM}}_o^{+}\right]}---\left(4\right)$其中V_m为细胞静息膜电位，[TMRM_o⁺]为细胞外TMRM浓度。