[发明专利]基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞膜电位和钠钾离子通透性比值的检测方法。 

背景技术

静息状态下，细胞膜内外两侧离子的不均匀分布以及不同离子在细胞膜上的通透性差异形成了细胞静息膜电位(resting membrane potential,RMP)，它是一切生物电产生和变化的基础，对许多功能性的膜蛋白如离子通道(ion channels)、转运体(transporters)、钠钾泵(pumps)、酶类(enzymes)等具有调节作用。RMP的改变对细胞膜功能蛋白的调节是电刺激信号转成细胞内信号转导的关键，并进而影响细胞的增殖，分化，凋亡等。因此准确检测RMP具有重要意义。由于细胞膜对氯离子的通透性相对较小，所以由Goldman–Hodgkin–Katz方程可知钠钾离子的浓度分布和它们在细胞膜上的通透性比值基本决定了细胞静息膜电位的大小。 

目前检测细胞静息膜电位主要通过膜片钳和电势荧光染料两种方法。膜片钳方法由于检测时对细胞有一定程度的损伤，且改变了细胞内的实际离子浓度比例，被钳制细胞容易死亡，更适用于对细胞通道蛋白的电生理行为进行检测。电势荧光染料方法是通过按电势分布的带电染料的荧光强度来指示细胞静息膜电位，具有非侵入性，更容易获取细胞真实的细胞静息膜电位，同时也能用于一些膜片钳方法无法操作的原位检测，检测通量也更高，但该方法存在检测精度不够高的问题。四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodamine,methyl ester,TMRM)是一种带一价正电荷的红色电势荧光染料，可自由通过细胞膜，在膜两侧形成稳定的能斯特平衡分布，对细胞的毒性相对较小，被认为是一种理想的检测细胞静息膜电位和线粒体膜电位的荧光染料。然而目前利用TMRM进行细胞静息膜电位检测时，对其荧光粒子在核区的非特异性吸附的标定是建立在吸附系数不变的前提下，这与文献报道的非特异性吸附存在饱和过程的结论存在差异，从而影响用TMRM标定细胞静息膜电位时的精度。因此，需要对TMRM的核区非特异性吸附进行标定，进而建立一种具有较高精度的细胞静息膜电位检测方法。 

钠钾离子通透性比值P_Na/K作为影响细胞静息膜电位的重要因素，常被作为研究细胞电生理的一个重要指标，尤其是在离子通道功能的研究中。细胞膜上的大部分离子通道蛋白都是特异性的对某一离子具有较高的通透性，但其对其它离子也会有一定的通透性，由于钠、钾离子是细胞内外的主要阳离子，因此钠钾离子通透性比值对离子通道蛋白的功能有决定性意义。大部分钠钾离子通透性比值的研究都聚焦在动作电位中快速响应的通道蛋白。近年来，静息状态下的一些基础激活的通道(漏通道)的钠钾离子通透性比值也被进行了研究，例如 K2P通道，Kir通道和非选择性阳离子通道(比如Nalcn，被认为是一种钠离子漏通道)。K2P通道被认为具有小于0.03的P_Na/K，Kir通道的P_Na/K被认为小于0.04。这些长期开放的通道对钠钾离子的通透性以及钠钾泵对钠钾离子的转运一起决定了静息状态的膜电位值。然而大部分P_Na/K的计算都是基于膜片钳方法，鉴于前述膜片钳方法存在的局限性，所以需要建立一种具有良好精度的非侵入性的钠钾离子通透性比值检测方法。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于对TMRM的核区非特异性吸附进行标定，进而建立一种具有较高精度的细胞静息膜电位检测方法，目的之二在于在所建立的具有较高精度的细胞静息膜电位检测方法的基础上，进一步计算钠钾离子通透性比值，进而建立一种具有较高精度的非侵入性的钠钾离子通透性比值检测方法。 

经研究，本发明提供如下技术方案： 

1.基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，包括以下步骤： 

B.TMRM荧光强度与浓度的关系标定 

将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测得的TMRM荧光强度与对应的TMRM浓度用式(1)进行拟合： 

F＝k[TMRM⁺]  (1) 

其中F为TMRM荧光强度，[TMRM⁺]为TMRM浓度；求得标定系数k； 

B.细胞核区TMRM的非特异性吸附标定