[发明专利]基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法

权利要求书

1.基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.TMRM荧光强度与浓度的关系标定

将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测得的TMRM荧光强度与对应的TMRM浓度用式(1)进行拟合：

F＝k[TMRM⁺]  (1)

其中F为TMRM荧光强度，[TMRM⁺]为TMRM浓度；求得标定系数k；

B.细胞核区TMRM的非特异性吸附标定

先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞完全去极化，则细胞内外游离TMRM浓度相等，再用一系列梯度浓度的TMRM溶液分别孵育细胞，测定细胞核区TMRM荧光强度，通过式(1)计算出细胞核区TMRM总浓度，再通过式(2)计算出细胞核区非特异性结合的TMRM浓度：

[TMRMi+]=[TMRMB+]+[TMRMif+]---(2)]]>

其中[TMRM_i⁺]为细胞核区TMRM总浓度，[TMRM_B⁺]为细胞核区非特异性结合的TMRM浓度；为细胞核区游离TMRM浓度，其值与胞外游离TMRM浓度相等；

然后，将计算出的细胞核区非特异性结合的TMRM浓度与细胞核区游离TMRM浓度用一配基两个独立结合位点的模型即式(3)进行拟合：

[TMRMB+]=[TMRMBmax1+][TMRMif+]KD1+[TMRMif+]+[TMRMBmax2+][TMRMif+]KD2+[TMRMif+]---(3)]]>

其中[TMRM⁺_Bmax1]和[TMRM⁺_Bmax2]分别为两个独立结合位点中最大非特异性结合的TMRM浓度，K_D1和K_D2分别为TMRM与两个独立结合位点的解离常数；求得[TMRM⁺_Bmax1]、[TMRM⁺_Bmax2]、K_D1和K_D2；

C.基于TMRM的细胞静息膜电位检测

用一定浓度的TMRM溶液孵育细胞，测定细胞核区的TMRM荧光强度，通过式(1)计算出细胞核区TMRM总浓度，将式(3)代入式(2)求解得到再通过式(4)计算出细胞静息膜电位：

Vm=-60log10[TMRMif+][TMRMo+]---(4)]]>

其中V_m为细胞静息膜电位，[TMRM_o⁺]为细胞外TMRM浓度。