[发明专利]抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法

摘要

本发明提供一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备与纯化的方法，包括种子扩增培养、发酵培养、离心收集菌体、菌体裂解、收集上清真空抽滤、分子筛层析、亲和层析、离子层析、异丙醇沉淀和PBS溶解等步骤。采用本发明方法最后获得抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的发酵含量为150-200mg/L发酵液，纯化后超螺旋比例质粒含量达90％以上。

主权项

抗肺癌T‑VISA‑BikDD质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液；b)将a)中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料；c)发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解；d)裂解后进行离心，收集上清液，用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤，抽滤后所得液体用异丙醇沉淀质粒进行浓缩，然后对浓缩液进行分子筛层析，去除浓缩液中的RNA杂质，收集含抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD的洗脱液；e)利用亲和层析分离上述洗脱液，去除非超螺旋的抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD，收集高超螺旋比例(90％以上)的抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD的洗脱液；f)将e)中收集的洗脱液进行离子层析，去除内毒素，收集含抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD的洗脱液；g)将f)中收集的洗脱液用异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml分装，4℃保存；其中，所述抗肺癌质粒T‑VISA‑BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。