[发明专利]抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法

权利要求书

1.抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液；

b)将a)中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料；

c)发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解；

d)裂解后进行离心，收集上清液，用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤，抽滤后所得液体用异丙醇沉淀质粒进行浓缩，然后对浓缩液进行分子筛层析，去除浓缩液中的RNA杂质，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

e)利用亲和层析分离上述洗脱液，去除非超螺旋的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD，收集高超螺旋比例(90％以上)的抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

f)将e)中收集的洗脱液进行离子层析，去除内毒素，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

g)将f)中收集的洗脱液用异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml分装，4℃保存；

其中，所述抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a)中进行种子扩增培养所采用的种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油25mL/L；

摇床培养条件为：37℃，250rpm，培养8-9h至菌体OD值为0.8-1.2；

发酵罐培养条件为：37℃，pH值控制在6.8-7.0，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养至菌体OD值为0.8-1.2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b)中进行发酵培养所采用的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠3g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油80mL/L；

发酵培养条件为：37℃，pH值控制在7.0-7.2，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养20-24h至菌体OD值为95±5；

补料过程中所流加的培养基包括两种，补料培养基I的配方为：胰蛋白胨33g/L、酵母提取物66g/L、甘油500mL/L；补料培养基II的配方为：磷酸氢二钠40g/L、磷酸二氢钾20g/L，谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸和异亮氨酸均为微量；

具体流加方式为：发酵开始后第2.5h按发酵液体积的3％流加补料培养基I，第3.5h按发酵液体积的4％流加补料培养基I，第4.5h按发酵液体积的5％流加补料培养基I，第5.5h按发酵液体积的6％流加补料培养基I，第6.5h按发酵液体积的7％流加补料培养基I，第7.5h按发酵液体积的8％流加补料培养基I，第8.5h按发酵液体积的8-12％流加补料培养基I；补料培养基II在发酵开始后第10h一次性加入，加入量为发酵液体积的0.5％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，c)中裂解的具体方法为：向50g离心收集的湿菌体中加入1L的P1缓冲液，混匀后静止10min，然后加入1L的P2缓冲液，混匀后静止4min，最后加入1L的P3缓冲液混匀，4℃静止10min；

其中，P1缓冲液为:50mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0；

P2缓冲液为:200mM NaOH，1％SDS；

P3缓冲液为:3.0M醋酸钾，冰醋酸调pH5.5。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，d)中抽滤后所得液体用中空纤维柱或300KD的膜包进行浓缩，浓缩至滤液体积的1/25，并用B1缓冲液透析所得浓缩液，透析后的溶液再用B1缓冲液定容至滤液体积的1/20，然后进行Sepharose 6FF分子筛层析，上样量为柱体积的1/10，使用前用B1缓冲液平衡1个柱体积，上样完成后继续用B1缓冲液洗脱，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

B1缓冲液为：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.5。