[发明专利]抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的大量生产与纯化方法。

背景技术

质粒DNA作为生物药剂(尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体)的意义和需求越来越大，近年来，重组质粒用于基因治疗得到了广泛深入地研究，目前肿瘤基因治疗大多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子，缺乏组织特异性。有研究者使用肿瘤特异性启动子替代CMV进行基因治疗研究，结果发现，肿瘤特异启动子的活性极低(一般仅为CMV启动子活性的1％左右)，其疗效有限。针对肿瘤特异性启动子活性低这一科学问题，中山大学附属肿瘤医院谢小明教授团队于2007年开发了肿瘤特异性启动子放大系统(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier,VISA)。VISA系统大大提高了转基因效率，并增加转基因总表达指数(Total Expression Index,TEI)。经实验证实，VISA系统可平均增强肿瘤特异性启动子活性600-700倍，同时增加了TEI，延长表达时间3-4倍，明显提高了基因治疗的疗效，减少了给药次数和有效剂量。VISA系统已于2010年获得美国专利和商标局(USPTO)授予的发明专利权(US7723104B2)。以T-VISA-BikDD为基因治疗载体，与多个抑癌基因或促凋亡基因结合，在高特异性灭杀乳腺癌、前列腺癌及肺癌等体内外实验中均取得良好的效果。Bik(Bcl-2interacting killer)是Bcl-2家族成员，具有凋亡诱导活性，能有效地结合Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xl等凋亡抑制蛋白，发挥促凋亡作用。BikDD是突变型的BiK，比BiK的促凋亡作用更强。因而其可以更好地应用于肿瘤的基因治疗。

基因治疗已成为一些重大疾病的有效治疗策略，目前携带治疗基因的重组质粒已作为基因药物进入临床研究。与蛋白类的生物制品一样，对用于基因治疗的生物制品的生产与质量控制都有相当严格的要求。目前，国内外已有多家制药公司正在建立大规模符合药学规格的质粒DNA生产工艺，如批量发酵，纯化等规模化制备环节，以满足日益扩大的临床需求，但这些生产工艺中还存在一些难以克服的瓶颈，例如载体构建、发酵细菌质粒拷贝数、细胞裂解、纯化过程中细菌染色体DNA去除、细菌内毒素去除、终产品质量控制等。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的大量生产与纯化方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗肺癌T-VISA-BikDD质粒的制备方法，包括以下步骤：

a)用摇床或发酵罐进行含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的大肠杆菌种子扩增培养，获得种子液；

b)将a)中获得的种子液接入发酵罐进行发酵培养；发酵过程中，通过流加培养基的方式进行补料；

c)发酵结束后，离心收集菌体，用裂解溶液对收集的大肠杆菌菌体进行裂解；

d)裂解后进行离心，收集上清液，用0.45μm的砂芯漏斗进行真空抽滤，抽滤后所得液体用异丙醇沉淀进行浓缩，然后对浓缩液进行分子筛层析，收集含抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

e)利用亲和层析(例如PS柱层析)分离上述洗脱液，收集含超螺旋的质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

f)将e)中收集的洗脱液进行离子层析，收集含质粒T-VISA-BikDD的洗脱液；

g)将f)中收集的洗脱液用异丙醇沉淀，冰浴2h；4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀；然后用70％乙醇清洗沉淀1次，4℃，17000g离心15min，弃上清，收集沉淀，挥干乙醇，加入适量PBS溶解沉淀，使质粒含量1mg/ml，4℃保存。

其中，所述抗肺癌质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。质粒T-VISA-BikDD是一种能在肺癌细胞中高效高特异表达靶基因的质粒，在临床治疗肺癌疾病中具有极大的潜在应用前景。

前述的方法，a)中进行种子扩增培养所采用的种子培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L、磷酸二氢钾2g/L、甘油25mL/L。

摇床培养条件为：37℃250rpm，培养8-9h至菌体OD值为0.8-1.2。

发酵罐培养条件为：37℃，pH值控制在6.8-7.0，搅拌与溶氧偶联，溶氧控制在30-35％，通风比为0.8-1.0，培养至菌体OD值为0.8-1.2。