[发明专利]基于肠上皮细胞对35nm的纳米银生物安全性的评价方法

摘要

本发明基于肠上皮细胞对35nm的纳米银生物安全性的评价方法选取人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞株作为研究对象，采用细胞毒性较强的纳米氧化锌（26.21nm）为阳性对照，不加入纳米材料的正常细胞为空白对照，通过AO/EB双染法、WST-1法初步探究究纳米材料的细胞毒性。使用氧化应激的方法，通过检测Caco-2细胞内ROS、SOD、GSH释放量的影响，来探讨纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。实验结果表明，35.48nm的银粒子在低剂量（<50µg/ml）时对肠上皮细胞的活性没有影响，不会造成氧化应激损伤；在染毒剂量为75µg/ml和100µg/ml对肠上皮细胞（Caco-2）的毒性存在剂量-效应和时间-效应，并对细胞造成了程度较弱的氧化应激损伤。

主权项

一种基于肠上皮细胞对35.48nm的纳米银生物安全性的评价方法，其特征在于包括如下步骤：1）细胞培养：将人结肠癌上皮细胞Caco‑2细胞株加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在培养箱内培养，细胞生长2~3 d换1次液，取对数生长期细胞进行后续实验；2）细胞传代：Caco‑2细胞贴壁生长，经过3~4 d，细胞生长至单层80%~95%时，弃掉上清液，用适量PBS轻轻冲洗，弃掉废液，加入0.25%胰蛋白酶进行消化3‑5 min，在倒置显微镜下观察到细胞刚刚变圆时，加入少量10%胎牛血清的DMEM培养基终止细胞消化过程，用吸管吸取培养基，轻轻吹打使细胞不再贴壁，将细胞悬液转移到新的培养瓶中，并加入适量培养基，放入培养箱中培养3‑4 d后，进行下一次传代培养；3）将纳米银和纳米氧化锌粉末分散在无血清的DMEM培养基中，制成不同浓度的纳米银、纳米氧化锌悬液，放入4 ℃冰箱中备用，因为这两种纳米材料易发生团聚，使得该分散体系不稳定，因此每次使用前，需使用超声波细胞破碎仪使纳米材料解聚；4）通过AO/EB双染法、WST‑1法进行细胞毒性分析，使用氧化应激法，通过Caco‑2细胞内ROS、SOD、GSH水平检测，来分析纳米银对细胞的氧化损伤作用及可能机制。