[发明专利]判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法

摘要

本发明属于涉及生物研究的基础领域，具体涉及一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法。本发明方法选用水稻吐出的水滴来作为韧皮部汁液的替代品进行Bt杀虫蛋白的测定。将经过常规浸种、催芽处理的水稻种子平铺到塑料托盘中，加入适量的营养液，放置于人工气候箱内，待种子出苗5天后，每天早晨使用移液枪收集水稻尖部的水珠，然后存放于离心管中，最后用蛋白酶联免疫检测试剂盒测定Bt杀虫蛋白的含量。本发明的有益效果有：本发明的判断转基因水稻韧皮部汁液中杀虫蛋白含量的新方法适用于多种主要作物，操作简单，极易掌握，并且整个取样过程中植株个体未受到损伤，完全避免了污染的可能，保证了结果的准确性。

主权项

一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)将经过浸种、催芽处理的转基因水稻种子平铺到塑料托盘中，加入清水使其没过上述水稻种子，然后将塑料托盘放置于人工气候箱；所述放置条件是：温度28℃、湿度75％、先光照14小时后黑暗10小时，且所述光照的照度为22000LX，当水位低于水稻根系位置时从塑料托盘边缘加入清水进行补充，以保证水位没过水稻根系；待到水稻芽变绿，加入以没过水稻根系用量的营养液；(2)当步骤(1)中的水稻种子出苗5天后，每天早晨使用移液枪收集水稻苗叶尖部吐出的水珠，然后存放于离心管中，每份样品标记好时间、样品名称，并放置于‑20℃冰箱内储存，所述每个水稻品系至少收集3毫升的样品；(3)待样品收集完毕，将同一水稻品系每天收集到的样品混合在一起，振荡均匀，然后每个水稻品系设定三个重复，每个重复取1毫升样品加入500微升PBS/0.55％Tween‑20并且振荡均匀；(4)将Bt纯蛋白用PBS/0.55％Tween‑20分别稀释到0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的浓度用作标准曲线的取样点；(5)然后先加50微升Cry1Ab酶结合物到酶标板的每个孔中，接着加入50微升的PBS/0.55％Tween‑20到第一个孔作为空白对照，加入50微升的Cry1Ab阳性对照到第二个孔，根据待测样品数量在酶标板剩下的孔中依次加入50微升的样品；(6)将酶标板放在桌面上并以画圈的方式摇匀20～30秒钟，然后放入摇床以200rpm、室温条件放置90分钟；(7)取出上述酶标板，将其翻转把孔里的液体倒进水槽中，然后加入PBS/0.05％Tween‑20，再将其翻转清空，随后在毛巾或纸巾上拍打酶标板，以确保液体清除干净，重复此过程三次；(8)然后在所述酶标板的每个孔中加入100微升基质；(9)接着同步骤(6)在摇床中放置30分钟；(10)所述酶标板的每个孔中加入100微升终止液，然后摇匀；(11)将所述酶标板放入MQX200酶标仪中以450nm条件读板，记录数据；(12)根据步骤(4)所稀释的不同浓度的样品的读板数据制作标准曲线，然后将水稻样品的读板数据带入标准曲线方程，从而得到水稻样品中Bt杀虫蛋白的含量。