[发明专利]判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法

权利要求书

1.一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将经过浸种、催芽处理的转基因水稻种子平铺到塑料托盘中，加入清水使其没过上述水稻种子，然后将塑料托盘放置于人工气候箱；所述放置条件是：温度28℃、湿度75％、先光照14小时后黑暗10小时，且所述光照的照度为22000LX，当水位低于水稻根系位置时从塑料托盘边缘加入清水进行补充，以保证水位没过水稻根系；待到水稻芽变绿，加入以没过水稻根系用量的营养液；

(2)当步骤(1)中的水稻种子出苗5天后，每天早晨使用移液枪收集水稻苗叶尖部吐出的水珠，然后存放于离心管中，每份样品标记好时间、样品名称，并放置于-20℃冰箱内储存，所述每个水稻品系至少收集3毫升的样品；

(3)待样品收集完毕，将同一水稻品系每天收集到的样品混合在一起，振荡均匀，然后每个水稻品系设定三个重复，每个重复取1毫升样品加入500微升PBS/0.55％Tween-20并且振荡均匀；

(4)将Bt纯蛋白用PBS/0.55％Tween-20分别稀释到0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的浓度用作标准曲线的取样点；

(5)然后先加50微升Cry1Ab酶结合物到酶标板的每个孔中，接着加入50微升的PBS/0.55％Tween-20到第一个孔作为空白对照，加入50微升的Cry1Ab阳性对照到第二个孔，根据待测样品数量在酶标板剩下的孔中依次加入50微升的样品；

(6)将酶标板放在桌面上并以画圈的方式摇匀20～30秒钟，然后放入摇床以200rpm、室温条件放置90分钟；

(7)取出上述酶标板，将其翻转把孔里的液体倒进水槽中，然后加入PBS/0.05％Tween-20，再将其翻转清空，随后在毛巾或纸巾上拍打酶标板，以确保液体清除干净，重复此过程三次；

(8)然后在所述酶标板的每个孔中加入100微升基质；

(9)接着同步骤(6)在摇床中放置30分钟；

(10)所述酶标板的每个孔中加入100微升终止液，然后摇匀；

(11)将所述酶标板放入MQX200酶标仪中以450nm条件读板，记录数据；

(12)根据步骤(4)所稀释的不同浓度的样品的读板数据制作标准曲线，然后将水稻样品的读板数据带入标准曲线方程，从而得到水稻样品中Bt杀虫蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法，其特征在于，所述步骤(2)中选用水稻苗叶尖部吐出的水珠为韧皮部汁液的替代品。

3.根据权利要求1所述的判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法，其特征在于，所述营养液的配方如下：

①将91.6g NH₄NO₃和88.6g CaCl₂溶解于1L蒸馏水中作为储备液1；②将40.3gNaH₂PO₄·2H₂O和71.4g K₂SO₄溶解于1L蒸馏水中作为储备液2；③将324gMgSO₄·7H₂O溶解于1L蒸馏水中作为储备液3；④将1.5g MnCl₂·4H₂O、0.934g H₃BO₃、0.031g CuSO₄·5H₂O、0.074g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.035g ZnSO₄·7H₂O、7.7gFeCl₃·6H₂O和11.9g柠檬酸一水合物溶解在800ml蒸馏水中，然后加入50ml浓硫酸，再加蒸馏水至1L作为微量元素储备液；⑤取储备液1、储备液2、储备液3各5ml和微量元素储备液4ml混合，并加蒸馏水至4L，然后用1NNaOH调PH，使PH值为4.5-5.0。