[发明专利]判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法

说明书

技术领域

本发明属于涉及生物研究的基础领域，具体涉及一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法。

背景技术

随着DNA重组技术的不断发展，利用基因工程技术培育的抗虫品种已经在世界范围内广泛种植，这些品种表达来自苏云金杆菌(Bt)的Cry毒素，现已成为害虫防治的一种有效手段。然而，转基因作物的生态风险特别是对环境和非靶标有机体的影响一直是人们关注的焦点。转基因抗虫作物对非靶标生物的影响主要是指对农田生态系统中非靶标的害虫、有益生物以及对作物不产生危害的昆虫类等的影响。由于不同类型的Bt杀虫蛋白具有不同的杀虫谱，因此转基因植物中不同的Bt基因表达必然会对非靶标昆虫产生直接或者间接的影响，这种影响与昆虫对Bt杀虫蛋白的敏感程度以及转基因植株中Bt杀虫蛋白的表达浓度有关。转基因作物会通过食物链和食物网影响更高营养级昆虫的生长发育及繁殖，影响以植食类昆虫为食的捕食或者寄生性天敌，进而影响整个营养层级的节肢动物种类组成和种群动态，引起农田群落结构的变化。

刺吸式害虫，特别是蚜虫是大多数农田中广泛存在的一种食草动物，由于其是许多常见的捕食性和寄生性天敌昆虫(比如草蛉、食蚜蝇和瓢虫等)的主要甚至是专一的食物，因此蚜虫经常被作为指示性生物来用于转基因作物的环境风险评价。根据蚜虫专性取食植物韧皮部汁液的特性，在转基因作物的韧皮部汁液中是否存在杀虫蛋白便成为杀虫蛋白能否通过食物链和食物网影响更高营养级昆虫的关键。

目前，国内外的研究中，常用的提取植物汁液的方法有两种，一种是使用微型毛血管，另一种是使用乙二胺四乙酸缓冲液直接从割破的叶片伤口处提取汁液。但是，第二种方法被证实在叶片被割破后，来自破损细胞的汁液会污染样品从而导致结果的不准确性，第一种方法虽然能避免污染的发生，但是操作过程比较繁琐，而且对技术的熟练度也要求较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种判断转基因水稻韧皮部汁液中是否含有Bt杀虫蛋白方法，具体包括如下步骤：

(1)将经过浸种、催芽处理的转基因水稻种子平铺到塑料托盘中，加入清水使其没过上述水稻种子，然后将塑料托盘放置于人工气候箱；所述放置条件是：温度28℃、湿度75％、先光照14小时(6:00-20:00)、后黑暗10小时(20:00-6:00)，且光照照度为22000LX，当水位低于水稻根系位置时从塑料托盘边缘加入清水进行补充，以保证水位没过水稻根系；待到水稻芽变绿，加入以没过水稻根系用量的营养液；

(2)当步骤(1)中的水稻种子出苗5天后，每天早晨使用移液枪收集水稻苗叶尖部吐出的水珠，然后存放于离心管中，每份样品标记好时间、样品名称，并放置于-20℃冰箱内储存，所述每个水稻品系至少收集3毫升的样品；

(3)待样品收集完毕，将同一水稻品系每天收集到的样品混合在一起，振荡均匀，然后每个水稻品系设定三个重复，每个重复取1毫升样品加入500微升PBS/0.55％Tween-20并且振荡均匀；

(4)将Bt(Cry1Ab)纯蛋白用所述PBS/0.55％Tween-20分别稀释到0.2ppb、0.4ppb、0.8ppb、1.6ppb、3.2ppb和6.4ppb的浓度用作标准曲线的取样点；

(5)根据蛋白酶联免疫检测(ELISA)试剂盒的说明书的要求，先加50微升Cry1Ab酶结合物到酶标板的每个孔中，紧接着快速加入50微升的PBS/0.55％Tween-20到第一个孔作为空白对照，加入50微升的Cry1Ab阳性对照到第二个孔，根据待测样品数量在酶标板剩下的孔中依次加入50微升的样品；

(6)将酶标板放在桌面上小心的以画圈的方式摇匀20～30秒钟，然后放入摇床以200rpm、室温条件放置90分钟；

(7)取出上述酶标板，迅速将其翻转把孔里的液体倒进水槽中，然后加入PBS/0.05％Tween-20，再将其翻转清空，随后在毛巾或纸巾上拍打酶标板，以确保液体清除干净，重复此过程三次；

(8)然后在所述酶标板的每个孔中加入100微升基质；

(9)同步骤(6)在摇床中放置30分钟；

(10)在所述酶标板的每个孔中加入100微升终止液，然后摇匀；

(11)将酶标板放入MQX200酶标仪中以450nm条件读板，记录数据；