[发明专利]一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用。本发明对恶臭假单胞菌XPSN进行基因改造，构建6‑羟基‑3‑琥珀酰吡啶3‑羟化酶基因失活的基因工程恶臭假单胞菌P‑HSP。其构建方法包括步骤引物设计、PCR扩增、构建敲除用重组质粒pK18mob‑hspB、将重组质粒转移入大肠杆菌S17‑1、双亲杂交。本发明还将基因工程恶臭假单胞菌P‑HSP作为生物催化剂应用于尼古丁转化反应生产6‑羟基‑3‑琥珀酰吡啶中。本发明中构建的基因工程菌株转化效率高，操作简便，菌株传代稳定，能够重复使用三次，降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。

主权项

一种用于6‑羟基‑3‑琥珀酰吡啶生产的基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用PCR技术，以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XPSN(保藏编号为CCTCC No.M 205038)基因组为模板，扩增得到命名为hspB的6‑羟基‑3‑琥珀酰吡啶3‑羟化酶基因的部分基因片段；(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的基因片段和pK18mob质粒进行双酶切，所述双酶切使用EcoRI和BamHI；(3)将步骤(2)中双酶切后的所述基因片段和所述pK18mob质粒用连接酶进行连接，构建敲除用重组质粒pK18mob‑hspB；(4)将步骤(3)中得到的所述敲除用重组质粒pK18mob‑hspB转化入大肠杆菌S17‑1中，作为双亲杂交的供体菌株；(5)选用恶臭假单胞菌XPSN作为受体菌株培养，将其与步骤(4)中得到的供体菌株进行双亲杂交，经过筛选和验证后获得基因工程恶臭假单胞菌，命名为P‑HSP，其中，所述步骤(1)中所述扩增使用上游引物PH‑F：5′‑ccggaattcggggacaaatgtggtggtg‑3′，下游引物PH‑R5′‑cgcggaatcccaagaactacccgaacaga‑3′；所述步骤(5)中的验证为PCR扩增验证，使用的引物为：上游引物为mob‑F：5′‑cggctcgtataatgtgtgga‑3′，下游引物为hspB‑R 5′‑ctacagaaaggtttccatagt‑3′。