[发明专利]一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取DNA的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及从牛羊奶及奶粉中提取DNA技术领域。公开了一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，首次将Chelex-100法与Glassmilk（玻璃奶）DNA纯化技术完美结合应用于牛羊液态奶及奶粉微量DNA提取上。鲜液态奶的采集量可控制在1-2ml，奶粉的量可控制在1-10mg，提取出的DNA浓度高、纯度极好，稳定不易降解。提取的DNA可以扩增500-1000bp以上的长片段基因序列，所得序列可开展后续的分子生物学分析。操作简单、用量少、耗时短，DNA纯度高，不易降解，取样方便、实用，可以避免血液和组织取样的困难问题，也不会引起动物应激反应，降低了其他取样方法为乳品企业及养殖户带来的不必要的损失。

主权项

一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，首次采用Chelex‑100加热释放DNA结合玻璃奶纯化办法进行基因组DNA的提取，其特征在于以下步骤：步骤一,离心管准备：采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；步骤二，白细胞收集①取牛或羊液态奶1‑2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS溶液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500rpm/min，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；步骤三，体细胞消化：向体细胞沉淀中加入5‑10%的Chelex‑100悬浮液280μL及20mg/ml蛋白酶K20μL，56℃保温30min以上；步骤四，核酸释放：高速震荡5‑10s，100℃煮沸8min；高速震荡5‑10s，13000rpm/min离心3min，将上清转移至离心柱中，10000rpm/min离心1min，收集液体；步骤五，核酸纯化：1）向收集液体中加入GlassMilk5‑10μL和900μL的gDNABinding Buffer，充分混匀，65°水浴15min，中间要反转几次；2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底沉淀；3）70%酒精500ul洗涤8000rpm/min离心1min，重复此步骤2次；4）加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000rpm/min离心1min，弃上清；5）8000rpm/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37°烘干箱放置5min直至完全干为止；6）加100μLTE，pH7.0，60℃水浴5min溶解DNA，8000rpm/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，‑20℃保存备用。步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；步骤九，基因比对：将测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，进行后续的分子生物学分析；