[发明专利]一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种快速从牛羊液态奶及奶粉中高效提取DNA的方法。

背景技术

在分子生物学实验中，提取DNA是一项最基础也是最常用的技术。对于奶牛或奶山羊，目前分离DNA的材料主要包括组织和血液，组织的收集主要采用剪耳法，而血液的收集主要采用尾静脉采血。我们在生产实践中发现，这两种方式都会对实验动物产生应激，影响奶牛、奶山羊的生产水平，一方面可能造成实验结果的偏差；另一方面对实验牛场来说也是一笔不小的损失。因此，找到一种对奶牛、奶山羊产生最小应激的DNA提取方法，显得尤为重要。

奶牛乳腺细胞自身的代谢和脱落都为奶牛中提供了大量的体细胞资源：平均每毫升牛奶中的体细胞数达到30万左右，基本达到了提取DNA的细胞浓度。因此，从牛奶中分离体细胞，进而提取DNA在理论上是可行的。

传统的提取DNA的技术程序主要是SDS碱裂解，热裂解苯酚/氯仿抽提方法。但牛奶及羊奶中存在大量的蛋白，脂类物质，使用传统方法提取DNA不但步骤繁琐，耗时长，苯酚/氯仿易于挥发强致癌物质，对实验人员身体相当有害，而且提取的DNA浓度较低、蛋白比例较高，容易降解，不易长时间保存等。所以开发一种快速高效的从牛羊奶中提取DNA方法是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，已达到快速、经济、方便、无毒害、纯度高、不易降解的效果，适用于分子杂交，荧光定量PCR，基因测序等高级别要求的分子生物学实验。

本发明通过以下技术方案实现：

一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，其特征在于牛、羊液态奶及奶粉的基因组DNA提取方法首次采用Chelex-100加热释放DNA及玻璃奶纯化基因组DNA的办法进行提取，具体实施步骤如下：

步骤一,离心管准备：采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；

步骤二，白细胞收集

①取牛奶或羊奶1-2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;

②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS(磷酸缓冲液)，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500r/min，常温(20-25℃)下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；

步骤三，体细胞消化：向体细胞沉淀中加入5-10%的Chelex-100悬浮液280ul及20mg/ml蛋白酶K20ul，56℃保温30min以上。

步骤四，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃煮沸8min；高速震荡5-10s，13000r/min离心3min,将上清转移至离心柱中，10000r/min离心1min，收集液体

步骤五，核酸纯化：

1）向收集液体中加入GlassMilk5-10μL,加入900μL的gDNA BindingBuffer，充分混匀，65℃水浴15min，中间要反转几次；

2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底；

3）70%酒精500ul洗涤8000r/min离心1min，重复此步骤2次；

4）加入500ul无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000r/min离心1min，弃上清；

5）8000r/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37℃烘干箱放置5min直至完全干为止；

6）加100μLTE（pH7.0）60℃水浴5min溶解DNA，8000r/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，-20度保存备用。

步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，85%以上所获得的基因组DNA浓度处于45-100ng/μL之间，纯度OD_260/280值处于1.8-2.0之间；

步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；

步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；

步骤九，基因比对：测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，可以进行后续的分子生物学分析。

PBS(磷酸缓冲液)配制如下：