[发明专利]一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取DNA的方法

权利要求书

1.一种快速从牛羊液态奶及奶粉中提取DNA方法，首次采用Chelex-100加热释放DNA结合玻璃奶纯化办法进行基因组DNA的提取，其特征在于以下步骤：

步骤一,离心管准备：采用2ml离心管，在高压灭菌锅中进行灭菌，备用；

步骤二，白细胞收集

①取牛或羊液态奶1-2ml，或者奶粉2mg溶于2ml无菌水中，将样品于2500r/mln，4℃离心30分钟;

②用小勺刮去离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLPH值7.4高压灭菌的PBS溶液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，在3500rpm/min，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀，重复3次；

步骤三，体细胞消化：向体细胞沉淀中加入5-10%的Chelex-100悬浮液280μL及20mg/ml蛋白酶K20μL，56℃保温30min以上；

步骤四，核酸释放：高速震荡5-10s，100℃煮沸8min；高速震荡5-10s，13000rpm/min离心3min，将上清转移至离心柱中，10000rpm/min离心1min，收集液体；

步骤五，核酸纯化：

1）向收集液体中加入GlassMilk5-10μL和900μL的gDNABinding Buffer，充分混匀，65°水浴15min，中间要反转几次；

2）室温放置5min，中间反转几次；4000rpm离心1min，弃上清，留管底沉淀；

3）70%酒精500ul洗涤8000rpm/min离心1min，重复此步骤2次；

4）加入500μL无水乙醇，吹打悬浮，洗涤8000rpm/min离心1min，弃上清；

5）8000rpm/min离心30S，用10μL枪头吸走残余液体，37°烘干箱放置5min直至完全干为止；

6）加100μLTE，pH7.0，60℃水浴5min溶解DNA，8000rpm/min离心5s，吸取上清转移至新的离心管中，-20℃保存备用。

步骤六，DNA质量检测：用Nanodrop紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度；

步骤七，特异性基因的选择：选择16SrDNA基因作为研究对象，在GeneBank中查找该基因序列，设计牛或羊的特异性通用引物；

步骤八，PCR扩增及测序：选择合适的PCR体系和反应条件，进行PCR扩增，对其产物使用PCR纯化试剂盒进行纯化，测序；

步骤九，基因比对：将测序所得基因序列，进入NCBI数据库中Blast比对，进行后续的分子生物学分析；

2.根据权利要求1所述的PBS溶液配制如下：

分别称取NaCL8g，KCL0.2g，Na₂HPO₄1.44g，K₂HPO₄0.24g，将各种物质溶解于800mL双蒸水中，调pH至7.4，加双蒸水定容体积至1L。

3.根据权利要求1所述5-10%的Chelex-100悬浮液配制如下：

称取Chelex-1005-10g，溶于95-90ml的双蒸水中，用时充分摇匀。