[发明专利]一种潜在的高效重组HIV‑1CRF07‑BCgp140免疫原的制备方法

摘要

本发明公开了一种潜在的高效重组HIV‑1CRF07‑BC gp140免疫原的制备方法。该免疫原基于国际上已经发表和本实验室获得的HIV‑1包膜蛋白晶体结构而设计，具体方法为运用重叠延伸PCR技术，获得gp140的基因片段，将目的基因克隆入真核表达载体pMT，经质粒大提去除内毒素后，与抗性筛选质粒pCoBlast一起共转染黑腹果蝇Schneider2(S2)细胞，用杀稻瘟菌素(Blasticidin S)进行阳性克隆筛选，筛选出稳定高效分泌表达gp140的S2细胞系。扩大培养后，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化，即可获得纯度很高的gp140。经一系列生物化学和生物物理技术证明该gp140聚合状态均一，抗原反应性高，非常适合作为免疫原用于艾滋病亚单位疫苗或多价联合疫苗的研发。

主权项

一种针对HIV‑1中国流行株CRF07的重组gp140免疫原的制备方法，其特征在于，将采用重叠延伸PCR技术获得的编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的基因片段gp140克隆入真核表达载体pMT/Bip/TEV‑HisA中；经质粒大提去除内毒素后，与抗性筛选质粒pCoBlast一起共转染黑腹果蝇Schneider2细胞，用杀稻瘟菌素进行阳性筛选，筛选出稳定高效分泌表达目的蛋白gp140的S2细胞系，扩大培养后，用硫酸铜诱导蛋白表达，取细胞上清，替换成镍柱结合缓冲液，经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化，即可获得高纯度的gp140；其中pMT/Bip/TEV‑HisA载体是将pMT/Bip/V5‑HisA的V5表位替换为烟草蚀纹病毒蛋白酶TEV酶的酶切位点获得的。