[发明专利]一种铁皮石斛体细胞胚的增殖保存方法及培养基

摘要

本发明公开了一种铁皮石斛体细胞胚增殖保存的方法及培养基，包括以下步骤：1）外植体的消毒；2）原球茎的诱导培养；3）体细胞胚的诱导；4）体细胞胚的增殖保存培养；5）体细胞胚的恢复生长与增殖培养；6）体细胞胚的萌发；7）试管苗的壮苗生根培养。采用本发明的方法进行铁皮石斛体细胞胚的增殖保存培养，培养物可连续保存12个月，保存期间在不需继代的情况下可增殖40倍，操作简单，成本低，恢复培养反应快。可以根据市场和生产的需要，在较短时间大量增殖或控制增殖速度加以保存。

主权项

一种铁皮石斛体细胞胚的增殖保存方法，包括以下步骤：1)外植体的消毒：取铁皮石斛蒴果，在超净工作台上，用75%酒精消毒45～60秒后，再用体积比为15～20%的次氯酸钠水溶液浸泡15～25分钟，无菌水冲洗3～5遍；2)原球茎的诱导培养：无菌操作吸干消毒后的铁皮石斛蒴果表面的水分，用解剖刀切开蒴果，挑取其种子，接种于原球茎诱导培养基上，先进行弱光照培养，20～30天后转移至光照培养，继续培养25～35天后，外植体萌发成圆锥状的原球茎，培养温度为25±2℃；原球茎诱导培养基配方是：MS基本培养基，6‑苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.5～1.5g/L，活性炭0.3～0.6g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；3)体细胞胚的诱导与增殖：将原球茎继代培养于体细胞胚的诱导与增殖培养基上，30天后原球茎产生体细胞胚并逐渐增殖；体细胞胚诱导与增殖培养基配方是：MS基本培养基，6‑苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg/L，6‑糖基氨基嘌呤0.2～0.8mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.4～0.8g/L，活性炭0.3～0.6g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；4)体细胞胚的增殖保存培养：将体细胞胚转接培养于体细胞胚增殖保存培养基，2个月后达增殖高峰；如果要进行快速繁殖，应转接于新鲜的体细胞胚增殖保存培养基再进行增殖培养；如不需进行快速繁殖，而要进行种质保存，则在达增殖高峰后不进行转接，继续在原增殖保存培养基上培养3～4个月，体细胞胚仍能缓慢增殖，并有少量体细胞胚开始萌发，培养10～12个月后，培养基大大减少，培养物聚集在一起，处于半饥饿状态，但基本保持良好的生命力，培养温度为25±2℃；体细胞胚增殖保存培养基配方是：MS基本培养基，6‑苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg/L，6‑糖基氨基嘌呤0.2～0.8mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.4～0.8g/L，活性炭0.3～0.6g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；5)体细胞胚的恢复生长与增殖培养：将增殖保存培养的体细胞胚，分散培养于新鲜的体细胞胚恢复生长与增殖培养基，1周后，体细胞胚即开始恢复生长，2周后逐渐增殖，获得铁皮石斛体细胞胚；体细胞胚恢复生长与增殖培养基配方是：MS基本培养基，6‑苄氨基腺嘌呤0.8～1.2mg/L，6‑糖基氨基嘌呤0.2～0.8mg/L，萘乙酸0.2～0.6mg/L，水解酪蛋白0.5～1.0g/L，香蕉泥80～120g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；6)体细胞胚的萌发：将增殖培养获得的铁皮石斛体细胞胚转接培养于体细胞胚萌发培养基，2～3周后体细胞胚逐渐萌发成幼苗；体细胞胚萌发的培养基配方是：MS基本培养基，6‑苄氨基腺嘌呤0.3～0.6mg/L，6‑糖基氨基嘌呤0.3～0.6mg/L，萘乙酸0.1～0.2mg/L，水解酪蛋白0.6～0.8g/L，活性炭0.3～0.4g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；7)壮苗生根培养：将铁皮石斛幼苗培养于壮苗生根培养基，30天后发育为完整的铁皮石斛组培苗；壮苗生根的培养基配方是：1/2MS基本培养基，萘乙酸0.3～1.0mg/L，活性炭0.3～0.5g/L，蔗糖2～4%，琼脂粉6～7g/L；所有培养基的pH为5.4～5.8。