[发明专利]利用电击仪转化大豆胚尖生长点的方法

摘要

本发明涉及一种大豆胚尖生长点转化方法。利用萌发2~3天的大豆种子，去掉种皮、一片子叶及真叶，暴露生长点后，将大豆胚尖进行酶解得到大豆胚尖原生质体，放入电击杯中进行电击，然后通过农杆菌侵染大豆胚尖原生质体，吸去表面菌液后放入暗处，共培养后接转到营养土中培养，再生率为89%，F1代检测转化率为5%。本发明未经组织培养阶段，也不需要严格无菌环境，操作简便，转化周期短，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。

主权项

一种大豆胚尖生长点转化方法，包括如下的步骤：1）大豆胚尖原生质体的获得     挑取种皮完整、无病斑且饱满的成熟大豆种子，准备500 mL口杯，将挑选好的大豆种子放入口杯附带的网兜中，于通风橱中在口杯底层倒入次氯酸钠溶液15 mL，然后加入浓盐酸5 mL，二者发生反应产生氯气，迅速将装有大豆的网兜放入口杯中，盖好盖子于通风橱中放置5小时；2）于超净工作台中，在9cm玻璃平皿中放入2张无菌滤纸，并加入8mL无菌水;每一平皿放入15粒消毒后的大豆种子；25‑28℃黑暗环境中萌发2~3d；取胚根萌发至0.5~2cm的大豆种子，利用镊子与解剖刀剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干；将胚尖浸入1%纤维素酶+1%半纤维素酶+0.25%果胶酶混合酶解液解液中处理，得到大豆胚尖原生质体；3）农杆工程菌菌液的制备挑取含有质粒 pSOY12 的农杆菌单菌落接种到10ml含抗生素50mg/L卡那霉素+50mg/L氯霉素+50mg/L壮观霉素的 LB液体培养基，28℃，200 r/min振荡培养至对数生长期；取1ml菌液放入50ml含相同抗生素的 LB培养基中，28℃，200rpm振荡14‑16小时，然后以1：50进行2次活化，培养至OD600 =0.5~0.7；将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm 离心5‑8min，收集菌体；重悬液重悬菌体，按1:10~1:20的比例浓缩菌体，制备好的工程菌液备用；其特征在于：4）电击仪电击大豆胚尖原生质体将大豆胚尖放入电极间隙为4毫米的电击杯中，再将电击缓冲液注入电击杯，使其与大豆胚尖原生质体充分接触，在2500V电压下电击，脉冲作用时间45μs,脉冲个数5个,脉冲间隔0.5 s；5）农杆菌侵染及共培养将经过电击的大豆胚尖原生质体放入预先制备好的农杆菌菌液中进行侵染20分钟，将侵染后的大豆胚尖原生质体放入灭好菌的带有2层滤纸的玻璃平皿中，每皿放置8粒，加入2~3mL无菌水，25‑28℃黑暗环境中暗培养；3天后，向平皿中加入5~10mL无菌水，25‑28℃光照环境下培养，直至胚尖顶端伸长至0.5~1cm，此时真叶也开始出现； 将泥炭土、珍珠岩、蛭石按4:1:1比例混合，将混合土壤装入直径5cm的黑色塑料软质小花盆中，充足浇水，将幼苗种入花盆中，光照培养至4‑6 片叶片长出后，移栽至大田或大型花盆中，直至开花、接种，收集种子；6）筛选，PCR检测将T0代种子种入土壤，当小苗长出4‑7片新叶时，用筛选剂喷洒植株，筛选出具有抗性的植株，采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测；PCR检测条件：Plate1μLF1（2.5μM）0.5μLR2（2.5μM）0.5μLdNTPs ( 2.5μM )2μLPCR buffer (10×)2.5μLTaq Enzyme（5U/μL）0.25μLddH2O18.25μLPCR 反应程序：94℃：4 min：94℃ 30s，56℃ 30 s，72℃ 45s，30个循环；72 ℃10 min。