[发明专利]利用基因敲入和核移植技术在转基因动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用基因敲入和核移植技术在转基因非人哺乳动物生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法，具体地，本发明提供了一种用于乳腺特异表达的供体构建物，所述构建物将人丁酰胆碱酯酶DNA编码序列定点整合于乳腺特异表达蛋白基因位点并成功转染非人哺乳动物胚胎成纤维细胞，幼年和成年体细胞，利用体细胞核移植技术进行克隆从而获得新的个体，其所携带的人丁酰胆碱酯酶基因能使非人哺乳动物乳腺稳定表达并分泌人丁酰胆碱酯酶全酶或单体。本发明方法所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒剂和有机磷化合物中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷化合物残留。

主权项

一种用于乳腺特异表达的供体构建物，其特征在于，所述构建物从5’至3'，依次包括可操作性连接的式I中所示的元件：A1‑B1‑C‑D1‑E1‑F   (式I)式中，(i)A1为5'同源臂序列，所述5'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1‑酪蛋白，αS2‑酪蛋白，β‑酪蛋白，κ‑酪蛋白，β‑乳球蛋白和α‑乳清蛋白；(ii)B1为剪接接受位点序列；(iii)C为含信号肽编码序列和重组蛋白的编码序列，所述重组蛋白编码序列编码丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白,其中，所述丁酰胆碱酯酶单体是不形成四聚体的单体，且所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：(I)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；(II)氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白；(iv)D1为终止密码子以及位于所述密码子下游的丁酰胆碱酯酶cDNA 3’末端UTR序列；(v)E1为位于基因定点整合位点下游的3'同源臂序列,所述的3'同源臂序列选自哺乳动物的乳腺特异表达蛋白基因组序列，所述的乳腺特异表达蛋白包括：乳清酸性蛋白(WAP)，αS1‑酪蛋白，αS2‑酪蛋白，β‑酪蛋白，κ‑酪蛋白，β‑乳球蛋白和α‑乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列来自同一蛋白的基因组序列，并且用于将外源基因定点整合入所述蛋白基因组序列的内含子1区域；(vi)F为抗性基因以及位于抗性基因两侧的Cre－loxP序列。