[发明专利]一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法

摘要

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，特别涉及一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法。本发明根据公布的对盲囊线虫，简单异尖线虫和宫脂线虫核糖体DNA的内转录区(ITS-1、5.8S、ITS-2)序列设计特异性引物，建立异尖科三种线虫的多重PCR反应，对线虫样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明，扩增的目的片段大小符合预期的设计，与预期扩增序列同源性分别达到96.2%、99.1%和99.9%。该多重PCR检测方法的特异性强，不能在除了检测的三种线虫之外的其他线虫DNA中扩增出条带；敏感性高，宫脂线虫能够检测到的最低浓度为500pg/μL，而对盲囊线虫和异尖线虫能够检测到的最低浓度则为50pg/μL。

主权项

一种异尖科三种线虫多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断方法，其特征在于包括如下步骤：①对盲囊线虫、简单异尖线虫、宫脂线虫的虫体DNA提取；②引物设计与筛选：设计的引物序列为：对盲囊线虫的特异性引物：   上游引物 Contra F: 5‑GGATATGCGGGCGTGTTGAT‑3（SEQ ID NO.1），下游引物 Contra R: 5‑CGTTCAAACCAGACAAGGAGC‑3（SEQ ID NO.2），异尖线虫的特异性引物：上游引物 Anisk F：5‑ CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT‑3（SEQ ID NO.3），下游引物 Anisk R：5‑ CCCTACGAAATGGCATACTTG‑3（SEQ ID NO.4），宫脂线虫的特异性引物：上游引物 Hystero F：5‑ GGGGCATAGGTGACATACTGG‑3（SEQ ID NO.5），下游引物 Hystero R：5‑ ACCACCAGCAGCACATCACC‑3（SEQ ID NO.6），③对步骤②所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；④按照步骤③的最佳PCR反应条件进行单重PCR扩增特异性验证；⑤按照步骤③的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增特异性验证；⑥按照步骤③的最佳PCR反应条件进行PCR敏感性验证。