[发明专利]一种快速组织培养石斛种苗的方法

摘要

本发明属于种植技术领域，具体涉及一种快速组织培养石斛种苗方法，所述的栽培方法包括：步骤1：共生真菌的分离及培养；步骤2：石斛组培苗的培养；步骤3：组培苗与共生菌共同培养；步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养。本发明所述的方法能快速获得石斛种苗且成活率达98％。

主权项

一种快速组织培养石斛种苗的方法，包括如下步骤： 步骤1：共生真菌的分离及培养 A.共生真菌的分离与纯化 采取野生石斛的生活根，0.1％升汞溶液浸泡2‑5分钟，无菌水冲洗3‑5次；切为0.05‑0.3cm²的组织段接种到共生真菌培养基上培养，培养条件为：20‑30℃，黑暗培养；当切口边缘长出真菌菌丝时，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化获得纯菌株； 所述共生真菌培养基为：葡萄糖或蔗糖10‑40g／L、燕麦粉10‑100g/L、松萝汁1‑150g/L、氯霉素或青霉素0.001‑1g／L、磷酸二氢钾0.01‑10g／L、硫酸镁0.01‑10g／L、酵母浸膏1‑10g/L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9，灭菌条件为：121℃、20分钟； B.共生真菌的发酵培养 将菌根真菌的斜面试管菌种活化后，转接于共生真菌培养基中，于20‑30℃恒温培养1‑30天，在菌落边缘取菌块接入液体共生真菌培养基中进行发酵培养；接入量按重量计为1‑10％，振荡转速20‑300转／分钟，20‑30℃暗培养1‑60天； 步骤2：石斛组培苗的培养 A.原球茎和丛生芽的诱导 取野生石斛当年生的嫩芽，用0.1％升汞溶液灭菌2‑10分钟，无菌水冲洗3‑5次后，剪取0.5‑3厘米带节的茎段，接种到诱导培养基上，在培养温度10‑30℃条件下，培养3‑30天；光照度1000～2500Lx，光照12小时／天； 所述诱导培养基为：MS、6‑苄基嘌呤0.1‑10mg／L、萘乙酸0.1‑10mg／L、蔗 糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； B.壮苗生根培养 将丛生芽转接至培养基1上培养5‑50天，培养条件为：光照强度为1000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃；株高达2cm以上时转接至培养基2培养10‑50天，培养条件为：光照强度为2000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃； 所述培养基1为：1／2MS、蔗糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、香蕉10‑40g／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； 所述培养基2为：1／2MS、蔗糖10‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、香蕉10‑40g／L、活性炭0.1‑10g／L、琼脂1‑30g/L，pH4‑9； 步骤3：组培苗与共生菌共同培养 取共生菌液体菌种1～30％接种于共生培养基中，在20‑30℃下暗培养3‑9天后，再将组培苗接入共培养10‑50天； 共培养条件：光照强度为1000‑3000Lx，光照周期为：光照／黑暗=14h／10h，温度20‑30℃； 共生培养基为：1／2MS培养基、马铃薯100‑300g/L、蔗糖20‑40g／L、松萝汁20‑200g／L、肌醇20‑200mg／L、琼脂1‑30g／L，pH4‑9； 步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养 A.自然光照下在瓶中炼苗5‑10天； B.将菌根化成功的组培苗从玻璃瓶中取出，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡3‑9分钟后晾干栽种到塑料盆中，在温度15‑35℃、湿度40‑80％和遮阳率为 50‑70％的条件下培养，炼苗期3‑12个月；栽培基质为经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。