[发明专利]一种快速组织培养石斛种苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于种植技术领域，具体涉及一种快速组织培养石斛种苗方法。

背景技术

石斛为我国传统名贵中药材，我国历版药典均有记载。中药石斛的原植物为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生草本植物。石斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效，常用于热病伤津、口干烦燥、病后虚热等多种病症。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管的作用。但由于人们长期无节制的采挖使自然资源枯竭，再加上铁皮石斛本身的繁殖率极低，现铁皮石斛成为国家重点保护的药材品种之一。因此人工种植铁皮石斛具有广阔的前景，但缺乏优质种苗是铁皮石斛种植业的瓶颈之一。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种快速组织培养石斛种苗的方法，成活率达98％。

本发明通过下述技术方案实现的：

一种快速组织培养石斛种苗方法，其特征包括以下步骤：

一种快速组织培养石斛种苗的方法，包括如下步骤：

步骤1：共生真菌的分离及培养

A.共生真菌的分离与纯化

采取野生石斛的生活根，0.1％升汞溶液浸泡2-5分钟，无菌水冲洗3-5次；切为0.05-0.3cm²的组织段接种到共生真菌培养基上培养，培养条件为：20-30℃，黑暗培养；当切口边缘长出真菌菌丝时，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化获得纯菌株；

所述共生真菌培养基为：葡萄糖或蔗糖10-40g／L、燕麦粉10-100g／L、松萝汁1-150g／L、氯霉素或青霉素0.001-1g／L、磷酸二氢钾0.01-10g／L、硫酸镁0.01-10g／L、酵母浸膏1-10g／L、琼脂1-30g／L，pH值为4-9，灭菌条件为：121℃、20分钟；

B.共生真菌的发酵培养

将菌根真菌的斜面试管菌种活化后，转接于共生真菌培养基中，于20-30℃恒温培养1-30天，在菌落边缘取菌块接入液体共生真菌培养基中进行发酵培养；接入量按重量计为1-10％，振荡转速20-300转／分钟，20-30℃暗培养1-60天；

步骤2：石斛组培苗的培养

A.原球茎和丛生芽的诱导

取野生石斛当年生的嫩芽，用0.1％升汞溶液灭菌2-10分钟，无菌水冲洗3-5次后，剪取0.5-3厘米带节的茎段，接种到诱导培养基上，在培养温度10-30℃条件下，培养3-30天；光照度1000～2500Lx，光照12小时／天；

所述诱导培养基为：MS、6-苄基嘌呤0.1-10mg／L、萘乙酸0.1-10mg／L、蔗糖10-40g／L、松萝汁20-200g／L、琼脂1-30g／L，pH4-9；

B.壮苗生根培养

将丛生芽转接至培养基1上培养5-50天，培养条件为：光照强度为1000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20-30℃；株高达2cm以上时转接至培养基2培养10-50天，培养条件为：光照强度为2000Lx～3000Lx，光照周期为光照／黑暗=14h／10h，温度20-30℃；

所述培养基1为：1／2MS、蔗糖10-40g／L、松萝汁20-200g／L、香蕉10-40g／L、琼脂1-30g／L，pH4-9；

所述培养基2为：1／2MS、蔗糖10-40g／L、松萝汁20-200g／L、香蕉10-40g／L、活性炭0.1-10g／L、琼脂1-30g／L，pH4-9；

步骤3：组培苗与共生菌共同培养

取共生菌液体菌种1～30％接种于共生培养基中，在20-30℃下暗培养3-9天后，再将组培苗接入共培养10-50天；

共培养条件：光照强度为1000-3000Lx，光照周期为：光照／黑暗=14h／10h，温度20-30℃；

共生培养基为：1／2MS培养基、马铃薯100-300g／L、蔗糖20-40g／L、松萝汁20-200g／L、肌醇20-200mg／L、琼脂1-30g／L，pH4.0-9.0；

步骤4：菌根化组培苗的炼苗培养

A.自然光照下在瓶中炼苗5-10天；

B.将菌根化成功的组培苗从玻璃瓶中取出，在0.1％的高锰酸钾溶液中浸泡3-9分钟后晾干栽种到塑料盆中，温度15-35℃、湿度40-80％和遮阳率为50-70％的条件下培养，炼苗期3-12个月；栽培基质为经121℃高压灭菌2h的新鲜苔藓，待苔藓凉至常温后用来种植。

所述步骤1进一步为：