[发明专利]一种ToRCH检测的荧光标记基因芯片试剂制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种能同时用于ToRCH,亦即弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疹病毒I/II型(Herpes Virus)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法。与现有技术相比，本方法具有高特异性，高灵敏度，操作时间短的特点，因此应用前景广阔。此外，本发明还提供采用上述制备方法所得的试剂，以及用于上述检测方法的试剂盒。

主权项

一种能同时用于ToRCH，亦即弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疹病毒I／II型(Herpes Virus)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法，该方法包括以下步骤： a)靶序列确定： 选择已见报道的弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疹病毒I／II型(Herpes Virus)的基因序列中一段特异性较好、片段长度适合的基因序列做为检测的靶序列；所选取的靶序列经过同源性比对检索后，认为是特异性较高的序列，具体如下： 弓形虫 CTATGGTCATGAACCTCAGCGCTTCTGGGAATTCGTTAAAGACATTCCGGAGAAGCTTTCGCAGCCCTCGCCAGTTCTGGAGCTCACTAGGACGCATGCAGGGCAGCCTGACAAGAACGGCGTGTTTTTCCTTGGGTCTAGAACGGTAACAAACGAGTGGAAAAAATCTTCCTCGTGGACCCACATTCTTGTGGGACACATG(SEQ.ID.NO.1) 风疹 CTGGCACCGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTTCCCCCCCACACCACCGAGCGCATTGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCCCCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCACGGTCGCCGTTGGCACCGCGCGCGCCGGGCTCCAGCCCCGCGCTGATATGGCGGCACCTC(SEQ.ID.NO.2) 巨细胞病毒 CACGGTTACCACCAACTGTCTCGTGAAAGCAGAAAATACCCACCTGACATGTAAGTGCAATCCGAATACCACATCTAATACCAACAATGGCAGCAAGTGCCACGCGATGTGCAAATGCAGGGTCACAGAACCCATTACCATGCTAGGCGCATACTCGGCCTGGGGCGCGGGCTCGTTCGTGGCCACGCTGATAGTCCTGCTGGTG(SEQ.ID.NO.3) 单纯疱疹病毒I型 GCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCAG(SEQ.ID.NO.4) 单纯疱疹病毒II型 GTCTAGGGTTGAACCGGCGAGGGCGGCCTCGGCCGGCGGAGCCCCGGAGCTCCGAAGGTCTGCGCGAGGCCGCTCTCCGAAGAGACGATGGGAGCCCCGCGTATATATCCGCGAGGGCCC(SEQ.ID.NO.5) b)探针与引物设计 设计的各病原体引物与探针具体序列如下： 弓形虫TOX 引物1：5’cy3—CTATGGTCATGAACCTCAGCGCT—3’(SEQ.ID.NO.7) 引物2：5’—CATGTGTCCCACAAGAATGTGG—3’(SEQ.ID.NO.8) 探针：5’NH3—TTTTTTTTTTTTTAGGGCTGCGAAAGCTTCTCCGGAATGTC—3’(SEQ.ID.NO.17) 风疹RV 引物1：5’cy3—CTGGCACCGACTGCTGCGCATG—3’(SEQ.ID.NO.9) 引物2：5’—GAGGTGCCGCCATATCAGCGCG—3’(SEQ.ID.NO.10) 探针：5’NH3—TTTTTTTTTTTTTAGCGGGTCTCAATGCGCTCGGTGGTGT—3’(SEQ.ID.NO.18) 巨细胞病毒HCMV 引物1：5’cy3—CACGGTTACCACCAACTGTCTC—3’(SEQ.ID.NO.11) 引物2：5’—CACCAGCAGGACTATCAGCGTG—3’(SEQ.ID.NO.12) 探针：5’NH3—TTTTTTTTTTTTTCACTTACATGTCAGGTGGGTATTTTC—3’(SEQ.ID.NO.19) 单纯疱疹病毒HSV I型 引物1：5’cy3—GCGAACTCGGTCTAACGTTACAC—3’(SEQ.ID.NO.13) 引物2：5’—CTGGCTCCAAGCGTATATATGCG—3’(SEQ.ID.NO.14) 探针：5’NH3—TTTTTTTTTTTTTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCC—3’(SEQ.ID.NO.20) 单纯疱疹病毒HSV II型 引物1：5’cy3—GTCIAGGGTTGAACCGGCGAGG—3’(SEQ.ID.NO.15) 引物2：5’—GGGCCCTCGCGGATATATACGC—3’(SEQ.ID.NO.16) 探针：5’NH3—TTTTTTTTTTTTTGGAGCTCCGGGGCTCCGCCGGCCGAG—3’(SEQ.ID. NO.21) c)引物标记： 在所有引物1的5’端用花菁素cy3进行标记，cy3的吸收和发射波长分别为548nm、562nm； d)探针修饰 探针的5端经过氨基修饰后固定到醛基活化的基因芯片片基上； e)待测样本模板提取： 用常规方法及试验步骤提取待测样本病原体的基因组； f)PCR扩增及荧光标记， 用RT‑PCR技术扩增模板，采用25ul体系，反应条件为95℃，30s；55℃，45s；72℃，60min，共35个循环； 成分   引物(cy3标记5’端) 10pM 0.2ul 10×PCR buffer 2.5ul 模板DNA 3ul DNA聚合酶 0.5ul 反转录酶 0.5ul dNTP 2ul ddH2O 补充至25ul g)点样，将氨基化的探针用去离子水稀释成50pmol／ul后，取0.5ul滴加在醛基片基上，室温放置过夜，用洗脱液洗脱10min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用； h)杂交，将PCR产物与片基上的探针进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液I(5×SSC,I％SDS)、洗脱液II(0.25×SSC,1％SDS)各洗脱5min； i)结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果。