[发明专利]快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法是待小孢子胚状体产生时，将其转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养，3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂粉1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽；15～20d后，转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂粉的MS固体培养基中，20～30d后大多数植株长成健壮且生根的幼苗，可驯化移栽，培养条件都为90uE/m²/s、12hr/d、25℃。再生植株平均成苗率达83.5%。本发明有效解决小孢子胚易褐化、玻璃化的问题；有效缩短利用游离小孢子培养获得DH株系的时间；不需添加任何激素，更安全。

主权项

一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)花蕾的选择、预处理和灭菌：在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花蕾；将花蕾保湿并置于冰箱中冷藏静置24h后灭菌； (2)小孢子分离与纯化：向灭菌后的花蕾中加入B5‑13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾与B5‑13液体培养基的比例为每28‑32个花蕾中加入1～2ml的B5‑13液体培养基。 (3)培养液的分装、热激诱导：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装，小孢子密度1蕾/ml，封口后、热激诱导； (4)胚状体形成：将热激后的小孢子悬浮液于25℃黑暗静置培养，2～3周后出现肉眼可见的胚状体； (5)振荡培养：将上述胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养； (6)诱导再生植株：振荡培养3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15～20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂的MS固体培养基中，培养20～30d。