[发明专利]快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法

权利要求书

1.一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：包括如下步骤： 

(1)花蕾的选择、预处理和灭菌：在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花蕾；将花蕾保湿并置于冰箱中冷藏静置24h后灭菌； 

(2)小孢子分离与纯化：向灭菌后的花蕾中加入B5-13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中加入1～2ml的B5-13液体培养基。 

(3)培养液的分装、热激诱导：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装，小孢子密度1蕾/ml，封口后、热激诱导； 

(4)胚状体形成：将热激后的小孢子悬浮液于25℃黑暗静置培养，2～3周后出现肉眼可见的胚状体； 

(5)振荡培养：将上述胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养； 

(6)诱导再生植株：振荡培养3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15～20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂的MS固体培养基中，培养20～30d。 

2.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：单核靠边期对应的花蕾长度不结球白菜为2.0～3.0mm，青花菜为3.0mm～4.0mm。 

3.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：所述的B5-13液体培养基为小孢子提取液，是通过以下方法制备得到的：分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中，混匀，再加入130g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，然后调pH至6.0～6.2；于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。 

4.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：所述的1/2NLN液体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取NLN培养基的大量元素25ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中，混匀，再依次加入肌醇0.1g、谷氨酰胺0.8g、丝氨酸0.1g、谷胱甘肽0.03g、蔗糖130g，搅拌至完全溶解后，定容至1000ml，然后调pH至6.0～6.2；采用0.22μm的微孔 滤膜抽滤灭菌。 

5.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：所述的B5固体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中，混匀，再加入25g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，加热至沸腾后，加入10g琼脂粉，搅拌至完全溶解，调pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。 

6.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：所述的MS固体培养基是通过以下方法制备得到的：分别吸取MS培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液，椰汁100ml混合到500ml蒸馏水中，混匀，再加入30g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，加热至沸腾后，加入7.8g琼脂粉，搅拌至完全溶解，调pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。 

7.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于：步骤(6)中再生植株的培养条件都为90uE/m²/s、12hr/d、25℃。 

8.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的灭菌步骤是将预处理后的花蕾依次用体积浓度为75％的酒精和7％(v/v)的NaClO溶液消毒，无菌水冲洗。 

9.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的热激诱导是将小孢子悬浮液置于33℃高温下黑暗静置24h。 

10.根据权利要求1所述的快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，其特征在于所述的花蕾的选择是通过醋酸洋红压片法镜检确定小孢子的发育时期及与花蕾长度的对应关系，准确找到发育时期为单核靠边期的花蕾。