[发明专利]快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

芸薹属蔬菜属于异花授粉植物，杂种优势明显，在育种上获得一个纯系需要5～7年的时间，而游离小孢子培养可以在1～2年获得双单倍体植株，大大节省纯化时间和工作量。同时由于再生群体中单倍体的存在也有利于隐性性状的表达，丰富了育种资源。此外，游离小孢子属于单细胞，应用于诱变育种、突变体筛选和基因转化等有其特殊的优势，自发或人工加倍获得的DH群体更是进行分子标记和绘制基因图谱的理想材料。

游离小孢子培养技术，是由Lichter(1982)在甘蓝型油菜上首创的单细胞培养技术，随后加拿大、德国等国家相继开展了此项研究工作，提高了小孢子的胚诱导频率，于20世纪80年代末初步建立了甘蓝型油菜的小孢子培养体系。此后小孢子培养技术在芸薹属不同蔬菜中得到了迅速发展，创造了从花蕾机械分离小孢子的方法，确立了可提高诱导率的花蕾标准并将热激处理用于培养，并在芥菜、结球甘蓝、花椰菜、青花菜、大白菜等作物上获得成功。我国在游离小孢子培养方面的研究起步较晚，主要是借鉴国外的经验，但发展迅速。20世纪90年代，曹鸣庆等(1993)、陈玉萍等(1998)和严准等(1999)分别首次在不结球白菜、紫菜薹和球茎甘蓝等作物的游离小孢子培养上获得成功。2003年，朱允华等(2003)首次报道菜心游离小孢子培养成功。此外芸薹属蔬菜中青花菜、芥蓝、花椰菜也先后获得了小孢子再生植株。

但前人的研究主要聚焦在高效诱导胚状体的产生方面，对小孢子胚再生植株频率的研究甚少，而且缺乏深入的研究。但对于育种工作者来说，小孢子植株远比小孢子胚更具有实际意义。因此，如何获得高频率的小孢子再生植株非常关键，也是目前获得小孢子再生植株群体（DH）的主要限制因素。刘凡等（1997）的研究发现，小孢子胚能否顺利发育成植株，受内外两种因素的限制。小孢子胚在分化、继代培养过程中存在着褐化、玻璃化等现象，直接影响小孢子植株的再生率，因此本发明旨在建立稳定高频的不结球白菜和青花菜游离小孢子培养再生植株体系。

发明内容

本发明目的在于针对上述现有技术中获得游离小孢子再生植株存在的成苗效率低的问题，提供一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种快速高效获得芸薹属蔬菜游离小孢子培养再生植株的方法，该方法包括如下步骤：

(1)花蕾的选择、预处理和灭菌：在初花期和盛花期，选取发育时期为单核靠边期的花蕾；将花蕾保湿并置于冰箱中冷藏静置24h后灭菌；

(2)小孢子分离与纯化：向灭菌后的花蕾中加入B5-13液体培养基，采用挤压法使小孢子游离出来，然后过滤，收集滤液，离心，弃上清液，得到纯化后的小孢子；所述的花蕾与B5-13液体培养基的比例为每28-32个花蕾中加入1～2ml的B5-13液体培养基。

(3)培养液的分装、热激诱导：将纯化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液体培养基重新悬浮，然后分装，小孢子密度1蕾/ml，封口后、热激诱导；

(4)胚状体形成：将热激后的小孢子悬浮液于25℃黑暗静置培养，2～3周后出现肉眼可见的胚状体；

(5)振荡培养：将上述胚状体转到2000lx、25℃、60r/min摇床上振荡培养；

(6)诱导再生植株：振荡培养3～7d后将转绿的子叶型胚转移到含蔗糖2.5%，琼脂1%的B5固体培养基上继续培养获得再生芽，15～20d后，将其转入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%琼脂的MS固体培养基中，培养20～30d。

上述单核靠边期对应的花蕾长度不结球白菜为2.0～3.0mm，青花菜为3.0mm～4.0mm；

所述的B5-13液体培养基为小孢子提取液，是通过以下方法制备得到的：分别吸取B5培养基的大量元素50ml、微量元素5ml、铁盐10ml、有机元素10ml四种母液混合到500ml蒸馏水中，混匀，再加入130g蔗糖，搅拌至完全溶解，定容至1000ml，然后调pH至6.0～6.2；于121℃，1.1Mpa条件下灭菌20分钟。