[发明专利]一种多模块DNA文库及转录激活子样效应因子核酸酶质粒的构建方法

摘要

本发明公开了一种DNA文库及转录激活子样效应因子核酸酶质粒的构建方法，一种转录激活子样效应因子连接单元库，包括16组×n个双碱基识别模块和4组×m个单碱基识别模块，每个双碱基识别模块或单碱基识别模块两末端均有经二类限制性内切酶酶切形成第一粘性末端和第二粘性末端，n表示每组双碱基识别模块的数量，m表示每组单碱基识别模块的数量；DNA库包括与Tale连接单元库的连接单元数量相同的质粒，每个质粒包含一个碱基序列互异的连接单元，连接单元两末端与原始载体连接处有BsaⅠ酶切位点。采用本发明的DNA库用于构建转录激活子样效应因子核酸酶质粒，识别模块的酶切和连接能在一个反应中进行，可实现一步将19‑26个识别模块连接起来，速度快，效率高，操作简单，材料易于保存，成本低。

主权项

转录激活子样效应因子核酸酶质粒的构建方法，包括TALENs识别模块的连接，步骤包括：(1)根据所需识别目的基因靶序列的碱基序列，从多模块单元库中选择对应的连接单元；所述的多模块单元库包括：16组×n个双碱基连接单元和4组×m个单碱基连接单元，所需识别的碱基序列长度为2*n+2‑m至2*n+1；n＝12，m＝7；所述的单碱基连接单元为识别一个碱基的单碱基识别模块及两端经二类限制性内切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；任意两组单碱基连接单元的粘性末端碱基序列一一对应相同；对单碱基连接单元进行顺序编号，第k个单碱基连接单元的第二粘性末端与第k+1个单碱基连接单元的第一粘性末端互补，1≤k≤m‑1；所述的单碱基识别模块为编码SEQ ID No.1～4所示氨基酸序列的核苷酸；所述的双碱基连接单元为识别两个碱基的双碱基识别模块及两端经二类限制性内切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；任意两组双碱基连接单元的粘性末端碱基序列一一对应相同；所述的双碱基识别模块为编码SEQ ID No.5～20所示氨基酸序列的核苷酸；每组双碱基连接单元分为两个部分，第一部分的双碱基连接单元数量为p个，对第一部分双碱基连接单元进行顺序编号，第i个双碱基连接单元的第二粘性末端与第i+1个双碱基连接单元的第一粘性末端互补，1≤i≤p‑1；第二部分的双碱基连接单元数量为q个，对第二部分双碱基连接单元进行顺序编号为p+2～n+1，第j个双碱基连接单元的第二粘性末端与第j+1个双碱基连接单元的第一粘性末端互补，p+2≤j≤n+1；其中，每组第一部分的最后一个双碱基连接单元的第二粘性末端与编号为第p+1个单碱基连接单元的第一粘性末端互补；每组第二部分的第一个双碱基连接单元的第一粘性末端与编号第p+1个单碱基连接单元的第二粘性末端互补，1<p+1≤m；各组双碱基识别模块的粘性末端碱基序列一一对应相同；p＝2、3、4、5、6或7；所述多模块单元库中，识别4种碱基的第p+1个单碱基识别模块的核苷酸序列如SEQ ID No.41～44所示；每个单碱基或双碱基连接单元的粘性末端有4个碱基，沿5’‑3’方向，正义链的第一粘性末端的第2～4个碱基编码亮氨酸，正义链的第1个碱基为甘氨酸密码子的最后一个碱基；正义链的最后两个碱基为甘氨酸密码子的前两个碱基；沿5’‑3’方向，反义链的第二粘性末端的第1～3个碱基的互补序列编码亮氨酸，第4个碱基的互补序列为甘氨酸密码子的最后一个碱基；反义链的前两个碱基的互补序列为甘氨酸密码子的前两个碱基；同一组的所有双碱基连接单元或单碱基连接单元两端粘性末端的序列互不相同；编号为1～7的单碱基连接单元第一粘性末端和第二粘性末端的碱基序列分别如SEQ ID No.45～58的第9‑12个碱基所示；编号为1～p和p+2～13的双碱基连接单元第一粘性末端和第二粘性末端的碱基序列分别如SEQ ID No.45～44+2×p和SEQ ID No.47+2×p～70的第9‑12个碱基所示；(2)用二类限制性内切酶和DNA连接酶，将连接单元重组接入TALENs载体中，用消化线性DNA的酶进行消化处理，得到转录激活子样效应因子核酸酶质粒；步骤(2)中，将n+1个连接单元用DNA连接酶连接在一起形成TALENs识别模块，每个连接单元第二粘性末端与下一个连接单元的第一粘性末端互补；连接单元选自单碱基连接单元或双碱基连接单元；TALENs识别模块的第p+1个连接单元为所述单元库中第p+1个单碱基连接单元，TALENs识别模块的第m+1个至最后一个连接单元为双碱基连接单元，TALENs识别模块的第1至第p位、以及第p+2至第n+1位的连接单元为双碱基连接单元、单碱基连接单元或者双碱基连接单元与单碱基连接单元的混合。