[发明专利]黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用

摘要

本发明涉及一种检测黄瓜细菌性角斑病菌的实时荧光定量PCR检测技术及其应用。该检测技术利用荧光染料（SYBRGreenI）和正义引物、反义引物和阳性标准品，建立了实时荧光定量PCR反应体系，可以快速、定量地检测黄瓜细菌性角斑病菌。同时，该方法可直接定量检测模拟病种表面所带的病原菌，省去了提取病原菌DNA的步骤，大大节省检测的时间，降低检测难度，并能真实反应种子带菌量，为病害的早期预测和预警提供方法和基础。因此，该方法适合作为植物病害诊断检测方法推广应用。

主权项

一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：1）采用改良CTAB法提取病原菌总DNA，模拟种子带菌采用0.1%吐温20直接洗脱表面病原菌，得到相应的DNA样本；2）特异性引物设计，通过分析丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）不同致病变种的甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（gap1）基因序列，采用CLUSTAL方法进行序列比较，对黄瓜细菌性角斑病原菌设计了其特异性PCR引物对Pslgap1‑F/Pslgap1‑R，所述的引物对为：正义引物Pslgap1‑F序列为：5^，‑ TCGGCGACGCAATCAAT ‑3^，，反义引物Pslgap1‑R 序列为：5^，‑ GGTGGTTTCACGCTTCAGG ‑3^，；3）实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量反应体系为25µl，其中浓度为10µmol/L正义引物Pslgap1‑F和反义引物Pslgap1‑R各0.25µl、荧光染料SYBR Premix Ex Taq（内含TaKaRa Ex Taq TM HS，Mg²⁺，SYBR GreenⅠ和 dNTP Mixture）12.5µl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液0.5µl，ddH₂O补齐至25µl；4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，94℃ 30s，然后94℃ 5s、62℃ 30s为1个循环，共35个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；5）插入gap1片段序列的pMD‑20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度（2.6ng‑2.6fg DNA μl^‑1），按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的gap1基因片段拷贝数，进而得到原来样本中角斑病菌的浓度。