[发明专利]一种评估蜜蜂幼虫抗白垩病能力的方法

摘要

本发明公开了一种评估蜜蜂幼虫抗白垩病能力的方法，该方法采用恒温恒湿培养箱，移取1日龄蜜蜂幼虫入细胞培养板培养，于34~35℃温度、75~90%湿度下用蜜蜂幼虫培养饲料培养幼虫，三天后用白垩病病原菌孢子悬浮液对蜜蜂幼虫进行白垩病病原菌接种，接种后的6天之内统计幼虫白垩病死亡个数，死亡个数越少说明该蜂群蜜蜂幼虫的抗白垩病能力越强，采用此方法可准确判断蜜蜂幼虫的抗白垩病能力。该方法可以精确检测被考察蜂群蜜蜂幼虫的抗白垩病能力，避免在自然情况下外界不确定因素的干扰，有效提高蜜蜂抗白垩病育种种性考察的准确性。

主权项

一种评估蜜蜂幼虫抗白垩病能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：    （1）将白垩病干尸用质量浓度为10%的次氯酸钠消毒约10分钟后，用灭菌蒸馏水清洗2次，放在沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于34℃培养约2‑4天，在培养基上长出菌丝；（2）待菌丝变成黑色，即长出孢子后，用灭菌解剖刀将培养基上的黑色菌丝（含孢子）分离转移至灭菌过的研钵中，加入20uL灭菌的去离子水，进行研磨；研磨之后，加入50uL灭菌的去离子水使得孢子悬浮；悬浮液放置20分钟，从悬浮液的中部取50uL的样品；用血球计数板测定孢子浓度；配制成5×105个/ml的孢子悬浮液备用； （3）取一张工蜂巢脾放入蜂群中，将蜂王置于脾上产卵８小时，将已产卵巢脾放在蜂群的无王区，三天后，卵孵化为一日龄幼虫；（4）将一日龄幼虫用灭菌过的48孔板培养；配制幼虫食物，幼虫食物按质量配比计：新鲜蜂王浆50%、D‑葡萄糖6%，D‑果糖6%，酵母提取物1%，余量为灭菌的去离子水；食物保存于4℃冰箱中，饲喂之前34℃加热10分钟；用消毒之后的干燥的移虫针移取1日龄幼虫，之后幼虫于34.5℃温度、90%湿度的恒温恒湿箱中黑暗培养；幼虫在每天相同的时间饲喂一次；幼虫开始培养后的第一、二、三天每天喂20ul食物，三天后，每天增加10ul食物；第三天饲喂前6小时向每个蜜蜂幼虫接种步骤2配置的孢子悬浮液10ul；第七天幼虫开始化蛹，化蛹之后培养条件为34.5℃，75%湿度；不再喂食，每天用棉签轻轻擦拭板上的幼虫食物残渣和杂物；（5）每天定时观察步骤4培养的蜜蜂幼虫的患病情况，具体检测方法如下：将幼虫培养板放在解剖显微镜下，感染白垩病的幼虫通过身体失去弹性、颜色变为灰色或棕色、体表覆盖白色菌丝来鉴别，没有长出菌丝的幼虫要在第二天再次检测；统计各个被检测蜂群培养的幼虫总个数和1‑9日龄患白垩病死亡幼虫的个数，对各蜂群的幼虫患白垩病死亡个数和幼虫总个数相除得到幼虫白垩病死亡率，死亡率越低表明该蜂群蜜蜂幼虫的抗白垩病能力越强。