[发明专利]筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法

摘要

本发明公开了一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法。本发明提供的方法包括如下步骤：（1）将基因甲插入表达质粒后转化宿主菌，得到野生菌；将基因甲作为模板进行易错PCR，将易错PCR的产物插入表达质粒后转化所述宿主菌，得到的所有单菌落组成突变菌株库；基因甲为已知的具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的蛋白质的编码基因；（2）将野生菌和突变菌株库中的每个菌分别进行培养并收集发酵产物；（3）将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液；（4）采用DNS法筛选；（5）进行（a）和/或（b）；（a）薄层层析；（b）HPLC。本发明具有高效、快速、具有高通量等优点。

主权项

一种筛选具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的菌株的方法，包括如下步骤：（1）将基因甲插入表达质粒的多克隆位点后转化宿主菌，得到野生菌；将基因甲或含有所述基因甲的质粒作为模板并将所述基因甲作为靶区域进行易错PCR，将所述易错PCR的产物插入所述表达质粒的多克隆位点后转化所述宿主菌，得到的所有单菌落组成突变菌株库；所述基因甲为已知的具有将大量存在的人参皂苷转化为稀有人参皂苷的能力的蛋白质的编码基因；（2）将野生菌和突变菌株库中的每个菌分别进行培养并收集发酵产物；（3）将所述发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，得到反应液；（4）采用DNS法检测步骤（3）得到的反应液中的还原糖含量，测量OD_540nm吸光值；对于突变菌株库中的每个菌来说，如果某个菌进行步骤（3）得到的反应液的OD_540nm吸光值大于野生菌进行步骤（3）得到的反应液的OD_540nm吸光值，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株；（5）进行（a）和/或（b）；（a）将野生菌和步骤（4）筛选得到的菌株进行步骤（3）得到的反应液进行薄层层析；对于步骤（4）筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（3）得到的反应液中稀有人参皂苷的含量高于野生菌进行步骤（3）得到的反应液中稀有人参皂苷的含量，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株；（b）将野生菌和步骤（4）筛选得到的菌株进行步骤（2）得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷，然后用有机溶剂抽提，然后进行HPLC；对于步骤（4）筛选得到的菌株来说，如果某个菌进行步骤（2）得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后稀有人参皂苷的产量高于野生菌进行步骤（2）得到的发酵产物作用于所述大量存在的人参皂苷后稀有人参皂苷的产量，该菌株即为本步骤筛选得到的菌株。