[发明专利]免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增检测端粒酶的方法及试剂盒

摘要

本发明提供了一种新的端粒酶扩增方法——免洗涤的锚定延伸端粒亲和扩增（Washing-free，Anchored-extension and Telomeric-binding Amplification；WATA）。该方法利用一个锚定端粒酶引物进行端粒TTAGGGG序列（简称为G序列）延伸，以另一个带有通用PCR引物序列和6个单元的端粒CCCTAA序列（简称为C序列）的模板探针杂交结合在延伸的G序列上，通过酶切反应，除去未结合的模板探针，与G序列结合的模板探针进行PCR反应，扩增产物为一个固定长度的特异DNA片段。该方法将端粒酶活性检测过程简化为一管内完成的简单连续步骤，具有灵敏度高、特异性好等优点，适合推广到对各种来源的样品进行端粒酶活性检测。

主权项

1.一种免洗涤锚定延伸端粒亲和扩增端粒酶的方法，所述方法是将待测样品的细胞裂解上清液加入固定有端粒酶引物的PCR反应管中，冰上放置使端粒酶与引物结合，吸干上清后，加入由模板探针、抑制探针、缓冲液和dNTP组成的端粒酶反应体系，在30～37℃保温进行端粒G序列延伸反应，随即在55～65℃保温进行杂交反应，之后吸干，加入含有限制性内切酶和PCR引物的PCR反应液，先以37℃保温10分钟，随即进行PCR反应，PCR反应产物用于荧光定量或琼脂糖凝胶电泳分析；所述端粒酶引物序列如下：5’-TCCGTCGAGCAGA-3’；所述模板探针序列如下：5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGGATCCCTAACCCTAACCCTAACC CTAACCCTAACCCTAAGGATCGCTCGCGGCTCTT-3’；所述抑制探针序列如下：5’-TAGGGTTAGGGATCCTACA-3’；所述PCR引物序列如下：5’-CCGTCACCCTGGATGCTGTAGG-3’，5’-AAGAGCCGCGAGCGATCCTT-3’。