[发明专利]一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法

摘要

本发明公开一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法。步骤如下：人工合成WCFIP1成熟蛋白的基因，构建pET28/WCFIP1原核表达载体，将重组载体pET28/WCFIP1转入到大肠杆菌表达菌株BL21中，得大肠杆菌重组转化子；表达并纯化WCFIP1重组蛋白，重组蛋白用于免疫小鼠，制备了抗血清；利用硫酸铵分离抗血清，制备了特异性较高的抗WCFIP1蛋白的抗体。本发明首次实现WCFIP1高效表达和纯化，并制备了高特异性抗体（如摘要附图所示）。该重组蛋白和抗体的制备为WCFIP1蛋白检测与功能研究奠定了基础。

主权项

一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法，其特征在于，一种WCFIP1重组蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：（1）合成WCFIP1基因：根据WCFIP1成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了该蛋白的DNA序列；（2）WCFIP1成熟基因的克隆：用特异引物扩增出完整的基因片段，所用WCFIP1特异引物中引入BamH酶切位点和Hind酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得质粒WCFIP1/pMD20‑T，经过测序确定为正确表达序列；（3）构建原核表达载体：将表达载体pET28和步骤（2）所得的质粒WCFIP1/pMD20‑T经过Hind及BamH双酶切并纯化回收，并利用T4 DNA连接酶连接，得重组载体pET28/WCFIP1；（4）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：将步骤（3）所得的重组载体pET28/WCFIP1转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从大肠杆菌TOP10菌株中提取重组载体pET28/WCFIP1；用热激法将重组载体pET28/WCFIP1转入到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB 卡那霉素（Kan）抗性平板筛选得到包含有重组载体pET28/WCFIP1的大肠杆菌表达菌株转化子；（5）WCFIP1重组蛋白的表达：将步骤（4）所述的pET28/WCFIP1大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.4‑0.8时，加入浓度为0.05‑1.0 mM的IPTG，于37℃诱导8‑12小时，超声破碎，离心取上清液，得大量重组蛋白WCFIP1；（6）WCFIP1重组蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对WCFIP1重组蛋白进行纯化。