[发明专利]一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法

权利要求书

1.一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法，其特征在于，一种WCFIP1重组蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

（1）合成WCFIP1基因：根据WCFIP1成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了该蛋白的DNA序列；（2）WCFIP1成熟基因的克隆：用特异引物扩增出完整的基因片段，所用WCFIP1特异引物中引入BamH                                                酶切位点和Hind 酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒WCFIP1/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；（3）构建原核表达载体：将表达载体pET28和步骤（2）所得的质粒WCFIP1/pMD20-T经过Hind 及BamH 双酶切并纯化回收，并利用T4 DNA连接酶连接，得重组载体pET28/WCFIP1；（4）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：将步骤（3）所得的重组载体pET28/WCFIP1转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从大肠杆菌TOP10菌株中提取重组载体pET28/WCFIP1；用热激法将重组载体pET28/WCFIP1转入到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB 卡那霉素（Kan）抗性平板筛选得到包含有重组载体pET28/WCFIP1的大肠杆菌表达菌株转化子；（5）WCFIP1重组蛋白的表达：将步骤（4）所述的pET28/WCFIP1大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.8时，加入浓度为0.05-1.0 mM的IPTG，于37℃诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得大量重组蛋白WCFIP1；（6）WCFIP1重组蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对WCFIP1重组蛋白进行纯化。

2.一种WCFIP1特异性抗体的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（1）将抗原与弗氏完全佐剂混合至完全乳化，将乳化的抗原免疫昆明小鼠，在初次免疫结束后的第3周对经免疫的小鼠进行加强免疫，共进行2次加强免疫，两次加强免疫间隔2周，在第2次加强免疫后的第2周取小鼠的血液，并制备血清；（2）将WCFIP1重组蛋白包被酶联免疫吸附剂测定（ELISA）板，测定抗血清的效价，并分别利用50%和33%的硫酸铵进行分级沉淀和透析处理，对抗血清进行初步分离纯化；（3）以经IPTG诱导可以表达WCFIP1蛋白的大肠杆菌表达菌菌体总蛋白为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，蛋白质印迹结果表明，通过上述方法制备的抗体具有很高的灵敏度和特异性。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）所述，合成的WCFIP1 基序列如下： 5’-GTCAACGTGACCTACGACCCTTTCTTCGACAATCCTAATAATTCTCTTTCATA CGTTGCTTGCTCAGATGGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACACTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACATTGGTGGAGCATATGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGTGGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTTTCTATTAATATCCTTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACATTGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAACGCCGCAGTTGATTTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGGTTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3’。

4.根据权利要求1所述的生产方法，步骤（2）所用的引物序列如下：上游引物：5’-GCG GATCCGGTCAACGTGACCTACGAC-3’，下游引物：5’-GCAAGCTTCAAACCACAGACT GAAG-3’。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）所述的表达载体为pET28，表达菌株为大肠杆菌BL21。

6.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于步骤（3）所述的以IPTG诱导可以表达WCFIP1蛋白的大肠杆菌表达菌株的菌体总蛋白为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，分析结果显示通过该方法制备的抗体具有很高的特异性和灵敏度。

7.根据权利要求1-6任一项所述的生产方法制得的重组WCFIP1蛋白及其抗体。